山茱萸多糖對匹魯卡品致癇大鼠學習記憶能力的影響及機制

1.河南省南陽市第二人民醫院神經內科，河南 南陽 473000；2.河南省南陽醫學高等專科學校基礎醫學部，河南 南陽 473000

癲癇是腦部神經元異常放電所導致的大腦功能失調，流行病學調查資料顯示，其患病率為4‰～10‰，約有病人5千萬，其中難治性癲癇約占20%[1]。難治性癲癇患者中以顳葉癲癇最為常見，表現為自發性反復癇性發作，導致不同程度的學習和記憶功能障礙[2]。因此，積極尋找改善癲癇患者學習記憶能力的方法顯得尤為重要。癲癇的具體發病機制不清，氧化應激導致的細胞死亡在癲癇的產生中起重要作用[3]。山茱萸為山茱萸科植物山茱萸(CornusofficinalisSieb.et Zucc)的干燥成熟果肉，于秋末冬初成熟，別名山萸肉、蜀棗、石棗、萸肉、棗皮、藥棗等，味酸澀，性味酸澀，有固虛脫、澀精氣、補肝腎的功效，為我國傳統珍貴的滋補良藥，臨床上主要用于肝腎功能不全導致的腰酸背痛、乏力以及元氣虛脫引起的心悸、盜汗等[4]。山茱萸多糖為中藥山茱萸中提取的有效成份之一，現代藥理學研究表明其具有抗腫瘤、增強免疫、抗休克、降血糖、抗氧化、抗衰老等多方面的作用[5]，研究發現其具有提高多種疾病學習記憶能力的作用[6-7]，但是否能夠提高難治性癲癇患者的學習記憶水平，還未見相關報道。因此，本實驗擬通過建立鋰-匹魯卡品誘導大鼠癲癇模型，應用morris水迷宮檢測山茱萸多糖對癲癇大鼠學習記憶能力的影響，從氧化應激角度分析其作用的可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康清潔級S-D大鼠30只，雄性，體重200～300 g左右，購于河南省醫學動物中心，編號：201861035。分組飼養，室溫控制在20～25 ℃，空氣濕度控制在50%～55%，飲食與飲水均標準化供給，所有實驗大鼠均適應性喂養1 w后開始建模。

1.2 藥品和試劑 山茱萸多糖(南陽醫學高等專科學校藥學實驗室惠贈，臨用前用蒸餾水配制成0.05 g/mL)；匹魯卡品(批號：17023654，Sigma公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)皆購自于南京建成生物公司，試劑批號皆為20180713。

1.3 儀器 WMT-100型Morris水迷宮(四川成都儀器廠)；UV-2501分光光度計(日本島津)。

1.4 方法

1.4.1 顳葉癲癇模型建立 采用經典氯化鋰-匹魯卡品癲癇模型制備，參考文獻[8]，具體方法如下：首先腹腔注射127 mg/kg的氯化鋰，12 h后腹腔注射10 mg/kg阿托品，30 min后腹腔注射100 mg/kg匹魯卡品。如果大鼠癲癇持續發作超過1 h，或者出現嚴重抽搐則需要腹腔注射苯巴比妥至癲癇發作停止。根據經典發作標準，癲癇發作在Ⅳ級以上，且發作停止后狀態良好，癲癇模型大鼠制備成功。

1.4.2 分組 30只大鼠隨機分為對照組、癲癇模型組、山茱萸多糖干預組，各組10只。對照組采取常規飼養，不建立癲癇模型；模型組建立癲癇模型，常規飼養；山茱萸多糖干預組在建立癲癇模型后，采用0.28 g/kg 山茱萸多糖灌胃，持續灌胃14 d。

1.4.3 Morris水迷宮檢測 灌胃14 d后，Morris水迷宮檢測所有大鼠學習記憶能力，具體方法參考文獻[6]。

1.4.4 氧化應激反應指標測定 水迷宮實驗結束后，立即處死大鼠，快速在冰面分離大鼠海馬組織，用生理鹽水將取出的海馬組織制成10%勻漿，-80 ℃保存。嚴格按照試劑盒使用說明，采用化學比色法檢測海馬組織中SOD、MDA和GSH-PX含量。

2 結果

2.1 Morris水迷宮實驗

2.1.1 水迷宮定位航行實驗結果 與對照組比較，模型組大鼠逃避潛伏期時間明顯延長(P<0.05)；與模型組比較，山茱萸多糖干預組大鼠逃避潛伏期時間明顯縮短(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 各組大鼠定位航行實驗結果

組別第1天/s第2天/s第3天/s第4天/s對照組77.35±8.36 68.26±7.23 59.85±5.45 48.25±5.13模型組99.65±9.84?90.28±8.66?80.69±7.65?69.46±6.12?山茱萸多糖干預組82.68±11.36# 72.48±10.16 #64.39±10.32# 54.67±8.39#

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.1.2 水迷宮空間探索實驗 與對照組比較，模型組大鼠平臺象限路徑百分比與平臺象限停留時間明顯縮短(P<0.05)；與模型組比較，山茱萸多糖干預組大鼠平臺象限路徑百分比與平臺象限停留時間明顯延長(P<0.05)。見表2。

組別平臺象限路徑百分比/%平臺象限停留時間/s對照組58.32±6.21 25.32±5.13 模型組32.19±4.66?15.69±2.38?山茱萸多糖干預組49.29±8.39# 20.26±6.78#

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.2 海馬組織SOD、MDA、GSH-PX含量測定 與對照組比較，模型組大鼠海馬組織SOD、GSH-PX含量明顯降低(P<0.05)，MDA含量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，山茱萸多糖干預組大鼠SOD、GSH-PX含量明顯升高(P<0.05)，MDA含量明顯降低(P<0.05)。

組別SOD/NU/mgMDA/nmol/mgGSH-PX/U/g對照組90.36±12.58 0.86±0.25 75.28±11.29 模型組54.78±9.32?1.69±0.52?45.25±9.68?山茱萸多糖干預組74.58±11.83#1.18±0.75#66.76±9.97#

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

顳葉癲癇為難治性癲癇中最常見的一種類型，氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠模型是公認的最接近人類顳葉癲癇的動物模型[9]。70%顳葉癲癇患者都會伴隨不同程度的學習記憶功能障礙[2]。Morris水迷宮是目前世界公認的較為客觀的學習記憶功能評價方法，主要包括：定位航行實驗和空間探索實驗。通過本實驗研究發現，與對照組比較模型組大鼠逃避潛伏期時間明顯延長、平臺象限路徑百分比與平臺象限停留時間明顯縮短(P<0.01)，提示癲癇大鼠學習記憶能力水平明顯下降；而與模型組比較，山茱萸多糖干預組逃避潛伏期時間明顯縮短(P<0.01)、平臺象限路徑百分比與平臺象限停留時間明顯延長(P<0.05或P<0.01)，提示山茱萸多糖明顯提高癲癇大鼠的學習記憶能力水平。

氧化應激是癲癇發病機制中的重要過程。文獻報道匹魯卡品誘導的癲癇發作引起海馬、紋狀體等部位脂質過氧化物和NO含量升高，且在癲癇發生的早期出現SOD活力的下降[10]，從而導致海馬神經元損傷。SOD與GSH-PX為腦組織內天然的抗氧化酶，具有清除自由基的作用，SOD與GSH-PX含量越低，自由基含量越高，腦內細胞氧化損傷越嚴重。MDA為自由基過氧化反應的終產物，具有細胞毒性，加劇細胞膜的損傷[11]，MDA含量越高細胞膜氧化應激損傷越嚴重。研究結果表明癲癇大鼠SOD與GSH-PX含量降低(P<0.01)、MDA含量明顯升高(P<0.01)，提示癲癇大鼠海馬組織內產生氧化應激反應。山茱萸為臨床上廣為使用的名貴中藥，其有效成分多糖具有強抗氧化作用。通過本實驗研究發現通過山茱萸多糖干預作用后，癲癇大鼠SOD、GSH-PX含量明顯升高(P<0.05)，MDA含量明顯降低(P<0.05)，提示山茱萸多糖對癲癇大鼠具有抗氧化作用。

因此，山茱萸多糖具有提高癲癇大鼠學習記憶能力的作用，其機制可能是通過抗氧化作用來實現的。