常見動物原蟲病的顯微鏡快速檢查方法

2019-10-14 02:53:28朱石瓊魯富有解明華劉桂伶張容萍陳俊秀彭海生

養殖與飼料 2019年10期

朱石瓊魯富有解明華劉桂伶張容萍陳俊秀彭海生

1.云南省普洱市寧洱縣勐先鎮農業綜合服務中心，云南普洱 665104；2.云南省普洱市動物疫病預防控制中心，云南普洱 665000；3.云南省普洱市寧洱縣動物疫病預防控制中心，云南普洱 665199；4.云南省普洱市景谷縣動物疫病預防控制中心，云南普洱 666400

動物原蟲病比較繁多，分布十分廣泛，特別是血液原蟲病、球蟲病和附紅細胞體病（現列為立克次氏體），對畜禽養殖業危害極大。近年來，此類疫病的發病呈上升趨勢，部分病已呈局部流行。特別是豬、牛、馬、羊的焦蟲病，呈急性或慢性消耗性發病死亡，給廣大養殖戶造成了很大損失。近年來，筆者采用顯微鏡快速檢查診斷方法，結合流行病學等綜合分析，對10多例的動物原蟲病作出診治，為廣大養殖戶挽回了經濟損失。

1 原蟲

1.1 形態結構

原蟲是單細胞動物，整個蟲體由1個細胞構成。分類上屬于原生生物界，原生動物亞界。同高等動物的細胞一樣，原蟲具有細胞膜、細胞質和細胞核等主要細胞結構。

在光電顯微鏡下，原蟲細胞核外表變化很大，除纖毛蟲外，大多數均為囊泡狀，其特征為染色質分布不均勻，在核液中出現明顯的清亮區，染色質濃縮于細胞核的周圍區域或中央區域。有1個或多個核仁。核內體明顯，與核仁相似，但在有絲分裂過程中不消失。

原蟲有4種運動器官：鞭毛、纖毛、偽足和波動嵴。鞭毛很細，呈鞭子狀，鞭毛的大部分可能包埋在蟲體一側延伸出來的細胞膜中，從而形成一個鰭狀波動膜，如伊氏錐蟲；纖毛的結構與鞭毛相似，但數目更多；偽足是肉足鞭毛亞門蟲體的臨時性器官，可以引起蟲體運動以捕獲食物；波動嵴是孢子蟲定位的器官，只有在電鏡下才能觀察到。此外，原生動物還有一些特殊細胞器，即動基體和頂復合器。

1.2 生殖方式

原蟲的生殖方式分無性生殖和有性生殖2種。

1）無性生殖。二分裂生殖：即1個蟲體分裂為2個，分裂方式有縱二分裂和橫二分裂。裂殖生殖：也稱復分裂，細胞核和基本細胞器先分裂數次，而后細胞質分裂、同時產生大量子代細胞。裂殖生殖中的蟲體稱為裂殖體，1個裂殖體內可包含數十個裂殖子。孢子生殖：是配子形成的合子所進行的復分裂，經孢子生殖、孢子體可以形成多個子孢子。出芽生殖：即先從母細胞邊緣或細胞內分裂出1個或數個小的子個體，逐漸變大成單獨個體。

2）有性生殖。有結合生殖和配子生殖2種基本類型。結合生殖：多見于纖毛蟲，2個蟲體并排結合，進行核質的交換，核重建后再分裂為含有新核的蟲體。配子生殖：因為蟲體在裂殖生殖過程中出現性的分化，一部分裂殖體形成大配子體（雌性），一部分形成小配子體（雄性）。1個小配子體發育成熟后可以產生多個小配子，1個大配子體只產生1個大配子。小配子進入大配子體內結合形成合子，合子可以再進行孢子生殖。

1.3 宿主與寄生部位

絕大多數動物原蟲病（住肉孢子蟲除外）是由各種不同的原蟲寄生于各種動物細胞或造血器官引起的。其宿主可以有1個或2個（如球蟲）。原蟲的中間宿主以蜱螨和吸血昆蟲為主，如螫蠅、蠓、蚋、虻、虱等。

1.4 蟲體大小及檢查

1）蟲體大小。引起動物發病的原蟲十分微小，大小0.2～20.0 μm，人的肉眼不能直接觀察到，必須借助光學顯微鏡或電子顯微鏡將其放大后，才能觀察到蟲體或其蟲卵的形態和結構。普通光電顯微鏡，可以將血原蟲或細菌放大至1 000倍（100倍物鏡和10倍目鏡聯合放大），達到0.2～2.0 mm后，肉眼可以觀察。血液原蟲一般為無色半透明，經過染色后可在顯微鏡下清晰觀察到其形態結構。

2）原蟲的快速檢查。主要是采取血液（或胸腹腔液、糞便處物）涂片染色鏡檢。臨床上較常用的有革蘭氏染色、瑞特氏染色、姬姆薩染色、美藍染色等。血液涂片染色鏡檢適用于血孢子蟲引起的寄生蟲病，如豬、牛、羊、馬、犬焦蟲，牛、馬、羊伊低錐蟲，多種動物附紅細胞體（屬立克次氏體）；弓形蟲采取胸腹腔積液涂片或病料觸片染色鏡檢；球蟲可采集病變部位腸內糞便處理后的漂浮物，涂片檢查球蟲卵。采取相應的樣品涂片染色和顯微鏡檢，可以簡單、快速和準確地診斷動物原蟲病，在臨床診斷上具有重要意義。

2 檢查樣品涂片的制作

2.1 玻片要求

載玻片的大小、厚度等參數要符合國家標準。玻片要求完好無缺損，新開封的玻片不用清洗，使用時在酒精燈火焰上來回烘烤一下，以除去玻片上的水分和部分有機質，使玻片干燥透亮。舊玻片要用清潔劑清洗干凈并干燥后使用，使用前最好也用酒精棉球火焰烘烤一下。

2.2 樣品檢查步驟

清潔干燥玻片→血液（病料）涂片→自然干燥→甲醇（或火焰）固定→涂片染色（有的可不染色）→顯微鏡檢→顯微圖片采集→記錄。

2.3 樣品的采集

血液涂片應當采自于活體或瀕死期動物末稍血液或靜脈血，死亡時間較長的血液檢出率會降低，或因蟲體死亡或自溶而不能檢出。胸腹腔液采于致死或死亡時間很短的動物體腔。發病后未經治療的動物檢出率更高。采樣時必須注意，現場不能涂片的可用EDTA抗凝管，或用EDTA-K2抗凝管采集末稍血或靜脈血，冷藏保存，稍后涂片。

2.4 病料涂片制作

1）組織病料涂片或觸片：盡量在無菌條件下剪開新鮮的組織病料，輕輕觸片或涂在干燥、潔凈的玻片中央，編號后使之自然干燥，備用。

2）血液涂片：用吸管或移液器現場采集發病動物的新鮮全血，或用EDTA、或EDTA-K2抗凝管采集保存的抗凝血少許（5～10 μL），于潔凈玻片近端約1/3的中央，用另一玻片一端約45°向前推約2 cm，即成血液涂片，使之自然干燥，備用。臨床實踐中，在現場用玻片的一角，直接蘸取末稍血（或適檢血）一小滴，于玻片近端1/3處，玻片斜偏使血液成一直線后，于30°～45°向前推約2 cm即成。同一待檢血樣要同時制作血片3～5片備用，并做好編號。

3）胸腹腔液涂片制作：如弓形蟲的包囊、滋養體檢查，用無菌微量吸管或注射器，吸取胸腹腔液于玻片中央，輕輕涂抹均勻，形成薄膜，使之自然干燥，備用。

4）球蟲及蟲卵檢查涂片制作：急性死亡病例可從病變部位刮取少量黏膜置于載玻片上，加1～2滴生理鹽水混勻，加蓋玻片用高倍鏡檢查。或刮取少量腸黏膜做成涂片，用姬氏或瑞氏液染色，在高倍鏡下檢查，若見到有大量裂殖體和裂殖子即可確診。病畜禽采集病變部位腸內糞便5～10 g于100 mL燒杯中（或離心管中），加無菌水約50 mL攪拌使之沉淀，然后棄上清液，沉渣內加入飽和氯化鈉溶液或飽和硫酸鎂溶液，攪拌均勻后，取表層漂浮液于玻片上鏡檢，若見有大量卵囊即可確診。或吸取少量于玻片中央輕輕涂勻，形成均勻薄片，干燥，染色，鏡檢。為加快檢查時間，糞便處理溶液2 000 r/min離心，取上浮物檢查，效果更好。

5）注意事項：涂片時必須細心操作，涂片要薄且均勻，盡快干燥，防止涂片粘連或腐敗。

6）涂片的固定：自然干燥的涂片在染色前必須固定。酒精燈火焰固定：玻片背面在酒精燈火焰上來回3～5次，溫度不宜過高，以玻片背面接觸手背溫熱為準，否則可能使病原形態改變，影響觀察結果；甲醇固定：用吸管或移液器取分析純甲醇滴于涂片上，以充分覆蓋病料涂層為準，使之自然干燥后才能染色。

3 染色液配制與染色方法

3.1 革蘭氏染色液配制

革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法，可用于標本涂片或菌落涂片，染色后細菌與環境形成鮮明對比，可以清晰觀察到細菌的形態、排列及某些結構特征，主要用于臨床分類鑒定。臨床實踐中，也可用來染色血液原蟲。革蘭氏染色是由草酸銨結晶紫染液、碘溶液、脫色劑（乙醇）和沙黃染液4種染色液組成，按先后順序（紫、碘、脫、黃）進行復合染色。

1）結晶紫染液：結晶紫5 g，95%乙醇100 mL，1%草酸銨水溶液400 mL，按先后順序溶解混合，濾紙過濾后保存于棕色試劑瓶中備用。

2）碘溶液：碘（片）1 g，碘化鉀2 g，蒸餾水 300 mL，溶解，保存于棕色試劑瓶中備用。

3）脫色劑為95%乙醇。

4）沙黃染液：沙黃 1.0 g，95%乙醇 40 mL，蒸餾水360 mL保存于試劑瓶中備用。

3.2 染色方法

染色方法共包括以下6個步驟：

1）先加結晶紫染色液，初染1～2 min，用純凈水或自來水緩緩沖洗后甩干。

2）加革蘭氏碘液，媒染1～2 min，緩緩沖洗后甩干。

3）加95%乙醇，脫色10～20 s，緩緩沖洗后甩干。

4）加復紅染液復染（沙黃復紅染液或者石碳酸復紅染液）1～2 min，沖洗后使之自然干燥，或用吸水紙、中性濾紙吸干。

5）顯微鏡檢：革蘭氏陽性細菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。

6）注意在染色時染色液可完全覆蓋玻片涂層，并在規定的染色時間內保持液體不干為宜。

3.3 瑞氏染色液配制與染色

瑞氏染色液配制：取瑞氏染色素（粉）0.4 g（研磨），甲醇240 mL，充分溶解，濾紙過濾后，保存于棕色瓶中備用。

染色：適用于血液原蟲和附紅細胞體涂片的染色。用瑞氏染色液滴加在涂片上染色1～2 min，再加等量蒸餾水復染2 min，沖洗，干燥后鏡檢。

3.4 美藍染色液配制與染色

取美藍（亞甲基藍）1.2 g，95%乙醇120 mL，0.1%氫氧化鉀溶液400 mL，溶解混合后用濾紙過濾，保存于棕色瓶中備用。吸取染色液于涂片上染色2～3 min，沖洗干燥后鏡檢，蟲體呈藍色。

3.5 姬姆薩染色液配制與染色

取姬姆薩染色粉1.8 g，甘油150 mL，甲醇150 mL。先將姬姆薩染色粉與甘油混合，在55～60℃加溫1～2 h后，再加甲醇混合靜置1 d以上，用濾紙過濾后，置棕色瓶中備用（即為原液）。

姬姆薩染色（原液）的稀釋：使用時，原液按1∶4用中性蒸餾水稀釋后，即為工作染色液。

染色：適用于血液原蟲染色。工作液滴加在涂片上染色約30 min，或將玻片置染色缸中泡染30 min，沖洗、干燥后鏡檢。

3.6 瑞氏-姬姆薩復合染色液

瑞氏-姬姆薩染色液，是利用瑞氏改良技術原理改良而成，適用于血液原蟲涂片的染色。細胞的著色是染料透入被染物并存留其內部的過程，此過程既有物理吸附作用，又有化學親合作用。各種細胞及細胞內的各種成分由于其化學性質不同，對瑞氏-姬姆薩染色液中的酸性染料(曙紅)和堿性染料（亞甲藍）的親合力也不同。因此，涂片經瑞氏-姬姆薩染色液染色后，相應各類細胞呈現不同的著色，從而達到辨別其形態特征的目的。這種復合染色液可在市場上買到，染色時間短，只需3～5 min，染色效果好，價格便宜，在檢驗工作中經常使用。

3.7 商品染色液

若上述染色液配制困難，可直接采購商品染色液，方便且簡單。目前許多實驗室都采用商品化的染色液，如廣東珠海貝索生物技術有限公司生產的染色液品種齊全，質量良好。

4 顯微鏡檢查

4.1 普通光電顯微鏡檢查

1）懸滴壓片檢查法。如豬、牛、羊、馬等動物附紅細胞體檢查，可取新鮮血液少許于載玻片上，用微量液器加等量生理鹽水混合，加蓋玻片，在400～600倍低倍鏡、暗視野下仔細觀察多個視野，特別是玻片邊緣區聚集蟲體更多。附紅體附著在紅細胞表面，數量不等，紅細胞外形呈鋸齒狀排列，并可使動物紅細胞翻轉或不規則運動，可確定為感染附紅細胞體。感染嚴重伊氏錐蟲者，也可用此法在2 h內的新鮮血或抗凝血中查到，超過2 h蟲體會自行溶解。此外，球蟲處理漂浮物、疥螨等也可用此法檢查。

2）未染色血涂片鏡檢：血片涂好干燥后，未經染色也可在600倍以上的紅細胞中檢查到焦蟲，但輪廓不太清晰，或在紅細胞表面檢查到清晰的附紅細胞體。

3）染色涂片檢查法。檢查前，首先準備好性能良好和可正常使用的顯微鏡、擦鏡紙、香柏油或高級油鏡油。開啟顯微鏡電源5 min后，將染色干燥的玻片置于樣品臺上，調整物鏡、焦距、光源、濾光片等。先用10×10低倍鏡觀察視野中的物體，再依次用10×40、10×60的低倍鏡觀察到物體（血細胞或蟲體），再用10×100高倍鏡（油鏡）觀察，緩慢轉動微調至觀察物清晰時，滴加適量高級油鏡油或香柏油檢查，病原體的形態和著色情況會更加清晰。

油鏡常用的香柏油，能夠溶解復紅等染料，使染色退色，但容易干燥凝結，對油鏡造成損害，在發達國家已被禁用。目前國產的高級油鏡油可以取代香柏油，使用完后，用鏡頭紙直接擦干鏡頭即可，無需使用二甲苯清洗。

4.2 顯微圖片采集

有條件的實驗室，可采用帶有照像系統的顯微鏡檢查。如投影顯微鏡、奧林巴斯CX31型生物顯微鏡檢查，并把顯微圖片采集下來作永久保存。無照相系統顯微鏡條件時，可用手機拍照。即將視野調到最清晰時，用像素高的手機對準物鏡，輕輕調整到可清晰看到視野時拍照即可，這是筆者在多年工作實踐中發現的一種既方便又快速的圖片保存方法。