柱前衍生化高效液相色譜法測(cè)定他達(dá)拉非中氯乙酸殘留量

徐 然

（江蘇省南京市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇 南京 211100）

他達(dá)拉非（tadalafil）為口服磷酸二酯酶 V型（PDE5）抑制劑，用于治療男性勃起功能障礙（MED）。根據(jù)現(xiàn)有他達(dá)拉非合成路徑［1-3］，氯乙酸是他達(dá)拉非中可能殘留的特殊雜質(zhì)。氯乙酸含有基因毒性警示結(jié)構(gòu)，具有潛在基因毒性［4］。歐洲藥品管理局（EMEA）、美國(guó)食品藥品管理局（FDA）及人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）先后頒布了基因毒性雜質(zhì)控制的指導(dǎo)文件，均推薦以毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC，1.5 μg/d）來(lái)控制用藥風(fēng)險(xiǎn)［5］?；赥TC，以他達(dá)拉非最大口服劑量20 mg/d計(jì)算，氯乙酸限度須不超過(guò)75×10-6，故需建立專屬高靈敏度好的分析方法測(cè)定他達(dá)拉非中的氯乙酸殘留量。以往研究中主要采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)他達(dá)拉非的含量［6］、有關(guān)物質(zhì)［7］及異構(gòu)體雜質(zhì)［8］進(jìn)行控制。目前，對(duì)于測(cè)定水環(huán)境中氯乙酸的殘留，主要采用離子色譜法［9］和衍生化氣相色譜法［10］，尚未見(jiàn)有藥物基質(zhì)中氯乙酸殘留的測(cè)定報(bào)道。本研究中采用2-硝基苯肼與氯乙酸中的羰基在催化劑作用下發(fā)生縮合反應(yīng)［11-12］，將其轉(zhuǎn)化為具有較強(qiáng)紫外吸收的衍生化產(chǎn)物，進(jìn)而采用HPLC法進(jìn)行測(cè)定。

1 儀器與試藥

儀器：LC-20AT型高效液相色譜儀（配置LC-Solution色譜工作站，日本島津公司）；XS205型電子天平（瑞士梅特勒-托利多國(guó)際有限公司，分度值為0.1mg）。

試藥：氯乙酸（MCAA，純度為98%，昀冠＜上海＞生物科技有限公司）；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl，純度為97%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；2-硝基苯肼鹽酸鹽（2-NPH·HCl，純度為97%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；他達(dá)拉非原料藥（南京海融醫(yī)藥科技股份有限公司，純度大于 99% ，批號(hào)分別為 20170301，20170302，20170303）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A 相）-0.1%磷酸溶液（B 相），梯度洗脫，0 min 30%A ～70%B、12 min 55%A ～45%B；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：392 nm。

2.2 溶液制備

取氯乙酸約10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用80%乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為氯乙酸貯備液。精密量取一定量的氯乙酸貯備液，用80%乙腈逐級(jí)稀釋，配制成氯乙酸對(duì)照溶液。取2-硝基苯肼鹽酸鹽100 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用80%乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為衍生化試液。取1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽100 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為催化劑溶液。

圖1 衍生化反應(yīng)影響因素

2.3 衍生化步驟

空白溶液衍生化反應(yīng)：精密量取80%乙腈200 μL，置10 mL容量瓶中，再加入500 μL衍生化試液，500 μL催化劑溶液，加70%乙腈稀釋至刻度，搖勻。室溫反應(yīng)1 h后取20 μL進(jìn)樣。

對(duì)照品溶液衍生化反應(yīng)：精密量取氯乙酸對(duì)照溶液200 μL，置 10 mL 容量瓶中，再加入 500 μL 衍生化試液，500 μL催化劑溶液，加80%乙腈稀釋至刻度，搖勻。室溫反應(yīng)1 h后取20 μL進(jìn)樣。

供試品溶液衍生化反應(yīng)：取他達(dá)拉非原料藥20 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加入500 μL衍生化試液，500 μL催化劑溶液，加80%乙腈稀釋至刻度，搖勻，室溫反應(yīng)1 h，取20 μL進(jìn)樣。

2.4 衍生化條件優(yōu)化

為了確保衍生化反應(yīng)快速進(jìn)行，在室溫反應(yīng)條件下，選擇單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，對(duì)體系中衍生化試劑的用量、有機(jī)相的比例、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)體系pH等因素進(jìn)行考察。以生成的衍生化產(chǎn)物的峰面積（1 μg/mL）為指標(biāo)，考察了不同質(zhì)量濃度的2-硝基苯肼鹽酸鹽（0.20，0.50，0.80，1.00，1.25 g/L）、乙腈比例（10% ，30% ，50% ，70% ，90% ）、反應(yīng)時(shí)間（1，2，3，5，7 h）、反應(yīng)體系pH（4.0，5.0，6.0，7.0，8.0）對(duì)衍生化反應(yīng)效率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)，當(dāng)其他條件相同時(shí)，衍生化試劑質(zhì)量濃度在0.80～1.25 g/L范圍的2-硝基苯肼足以使衍生化反應(yīng)完全，因此將加入的衍生化試劑的質(zhì)量濃度設(shè)為1.00 g/L；當(dāng)反應(yīng)體系中乙腈比例達(dá)到70%、反應(yīng)時(shí)間為2 h時(shí)，衍生化產(chǎn)物的響應(yīng)達(dá)到最佳，而反應(yīng)液pH在考察范圍內(nèi)，衍生化產(chǎn)物的峰面積變化不大，因此選擇不調(diào)整反應(yīng)液pH直接反應(yīng)。最終確定衍生化反應(yīng)條件為與2-硝基苯肼（1.00 g/L）衍生化2 h后直接進(jìn)樣，反應(yīng)體系乙腈比例為70%。

2.5 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

氯乙酸與2-硝基苯肼反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)波長(zhǎng)見(jiàn)圖2。雖然在低波長(zhǎng)處吸光度較強(qiáng)，但色譜圖中的干擾也較嚴(yán)重。選擇392 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，他達(dá)拉非及其有關(guān)物質(zhì)無(wú)明顯吸收，色譜圖基線干擾較少，檢測(cè)靈敏度高。

圖2 紫外光譜圖

2.6 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別進(jìn)樣不含氯乙酸的空白衍生化反應(yīng)溶液、2 g/L他達(dá)拉非的衍生化反應(yīng)溶液、100 ng/mL氯乙酸的衍生化反應(yīng)溶液（不含催化劑）和100 ng/mL氯乙酸的衍生化反應(yīng)溶液（含催化劑），結(jié)果見(jiàn)圖3。可見(jiàn)，氯乙酸在催化劑存在的條件下可與2-硝基苯肼生成衍生化產(chǎn)物，保留時(shí)間約為10.1 min，空白溶劑和藥物基質(zhì)不干擾待測(cè)物的測(cè)定，方法專屬性良好。

圖3 專屬性試驗(yàn)色譜圖

線性關(guān)系考察：精密移取氯乙酸貯備液，用80%乙腈溶液逐漸稀釋，制成含氯乙酸 2.5，5.0，10.0，15.0，20.0，25.0 μg/mL 的溶液。取 200 μL 上述不同質(zhì)量濃度的氯乙酸溶液，置10 mL容量瓶中，按衍生化步驟，取20 μL 進(jìn)樣。最終氯乙酸的質(zhì)量濃度為 50，100，150，200，300，400，500 ng/mL，以氯乙酸質(zhì)量濃度（C，ng/mL）為橫坐標(biāo)、氯乙酸衍生物峰面積（A）為縱坐標(biāo)，按最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得回歸方程C=54.858A+333.82，r=0.9996（n=7）。結(jié)果表明，待測(cè)物質(zhì)量濃度在50～500 ng/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取質(zhì)量濃度為150 ng/mL的對(duì)照溶液，衍生化反應(yīng)后重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果的RSD為1.42% （n=6），表明儀器精密度良好。

定量限和檢測(cè)限確定：以信噪比（S/N）3∶1為本方法的檢測(cè)限，以信噪比（S/N）10∶1為本方法的定量限，衍生化反應(yīng)后，50 ng/mL氯乙酸衍生物的信噪比為13.2，作為定量限；20 ng/mL氯乙酸衍生物的信噪比為4.1，作為檢測(cè)限。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱取他達(dá)拉非20.03mg，置10mL容量瓶中，加入500 μL衍生化試液，500 μL催化劑溶液，加80%乙腈稀釋至刻度，搖勻，精密稱取他達(dá)拉非20.11mg，分別制備低（50.28ng/mL）、中（150.82ng/mL）、高（502.75 ng/mL）質(zhì)量濃度的加樣供試品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度各3份，按2.3項(xiàng)下方法反應(yīng)制得，另制備150.11 ng/mL氯乙酸的衍生化反應(yīng)對(duì)照溶液。分別取以上溶液進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

穩(wěn)定性試驗(yàn)：對(duì)150ng/mL氯乙酸對(duì)照溶液進(jìn)行衍生化后，于室溫下放置 0，1，2，4，6，8h 時(shí)測(cè)定，以待測(cè)物峰面積（A）的變化考察待測(cè)物的穩(wěn)定性。結(jié)果的RSD為2.64%（n=6），表明氯乙酸衍生物在室溫下放置0～8 h穩(wěn)定性較好。

2.7 樣品含量測(cè)定

取他達(dá)拉非供試品20 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加入500 μL衍生化試液，500 μL催化劑溶液，加70%乙腈稀釋至刻度，搖勻，室溫反應(yīng)2 h，取20 μL進(jìn)樣。同法測(cè)定150 ng/mL氯乙酸對(duì)照溶液，以峰面積計(jì)算含量，結(jié)果他達(dá)拉非樣品中的氯乙酸未達(dá)檢測(cè)限。

3 討論

色譜分離時(shí)，由于2-硝基苯肼顯堿性，pH越小出峰時(shí)間越早，為使其與衍生化產(chǎn)物足夠分離，選擇了酸性較強(qiáng)的0.1%磷酸溶液作為水相。通過(guò)對(duì)流動(dòng)相比例的優(yōu)化，進(jìn)一步提高了分離度，且不影響柱效。

以氯乙酸衍生物的色譜峰面積為指標(biāo)，此衍生化方法和色譜條件對(duì)其他藥物中氯乙酸殘留的測(cè)定同樣具有借鑒意義。衍生化溶劑需要完全溶解待測(cè)藥物，才能準(zhǔn)確測(cè)定藥物中的氯乙酸殘留，有機(jī)相比例過(guò)低會(huì)影響反應(yīng)效率，有機(jī)相比例過(guò)高會(huì)導(dǎo)致衍生化試劑的溶解度下降，進(jìn)而影響衍生化效率，對(duì)于該衍生化方法的應(yīng)用而言，溶劑對(duì)反應(yīng)效率和回收率的影響需要重點(diǎn)考察。