高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地蒲黃藥材中3種黃酮苷元含量

楊棣華，梁文能

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405）

蒲黃為香蒲科植物水燭香蒲Typha angustifoliaL.、東方香蒲T.orientalisPresl或同屬植物的干燥花粉，通常夏季采收，篩取花粉，作為藥用［1］。臨床主要用生品蒲黃和蒲黃炭，二者作用稍有不同，生品主要用于活血化瘀，蒲黃炭主要用于外傷出血［2-3］。蒲黃的主要活性成分為黃酮苷及苷元［4-5］。2015 年版《中國藥典（一部）》中采用薄層色譜和液相色譜對(duì)其苷元香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷進(jìn)行測(cè)定［1］。黃酮苷和苷元在藥理中都具有活性，黃酮苷類化合物也具有活血化瘀作用［6-7］。目前，對(duì)于黃酮苷類的測(cè)定方法主要有紫外光譜法［8-9］、毛細(xì)管電泳法［10］、高效液相色譜法［11-12］等，本研究中根據(jù)黃酮苷的化學(xué)性質(zhì)并參考文獻(xiàn)［13］建立高效液相色譜法，測(cè)定不同產(chǎn)地蒲黃中3種黃酮苷元的含量并比較其差異，為優(yōu)化蒲黃的質(zhì)量和臨床使用提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ulitimate3000型高效液相色譜儀，包括四元洗脫泵，DAD檢測(cè)器和變色龍工作站（美國賽默飛世爾儀器公司）；BSA-124S型電子天平（十萬分之一，德國賽多利斯公司）。

1.2 試藥

槲皮素對(duì)照品（批號(hào)為100081-201408，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 99.1%），山柰素對(duì)照品（批號(hào)為 110861-201310，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93.2%），異鼠李素對(duì)照品（批號(hào)為110860-201109，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%），均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；水為超純水（美國Milli-Q公司）；磷酸（分析純，國藥試劑化學(xué)有限公司）；蒲黃藥材分別來源于江蘇、內(nèi)蒙古、陜西、安徽、寧夏、湖北、四川、廣西8個(gè)不同產(chǎn)地的12批藥材（見表1），經(jīng)我院梁文能副主任藥師鑒定為香蒲科植物水燭香蒲Typha angustifoliaL.的干燥花粉，均符合藥典要求。

表1 不同產(chǎn)地蒲黃藥材樣品

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Hypersil BDS-C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 -0.4% 磷酸溶液（50 ∶50，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；進(jìn)樣量：10 μL。在此色譜條件下，理論板數(shù)按槲皮素峰計(jì)不低于 3690，拖尾因子為 0.95 ～1.05，各色譜峰分離度均大于1.5。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

取置五氧化二磷干燥12 h以上的槲皮素10.12 mg，精密稱定，置 25 mL容量瓶中，山柰素 5.82 mg置25 mL容量瓶中，異鼠李素6.05 mg置50 mL容量瓶中，加甲醇分別稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。分別精密吸取上述槲皮素對(duì)照品貯備液1 mL、山柰素對(duì)照品貯備液1 mL和異鼠李素對(duì)照品貯備液5 mL，置同一10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品混合溶液（每1 mL含槲皮素40.48 μg、山柰素23.28 μg、異鼠李素 60.50 μg）。取浙江湖州產(chǎn)的蒲黃藥材粉碎，過4號(hào)篩，取粉末1.0 g，精密稱定，精密加入甲醇 -25%鹽酸溶液（4∶1，V/V）的混合溶液 25 mL，加熱回流提取1 h，迅速冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密吸取對(duì)照品混合溶液1，2，5，10，25 μL，分別注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以進(jìn)樣量（X，ng）為橫坐標(biāo)、相對(duì)應(yīng)的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表2。

表2 方法學(xué)考察結(jié)果

精密度試驗(yàn)：取對(duì)照品混合溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣10 μL，重復(fù)6次，記錄峰面積。結(jié)果見表2，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品（批號(hào)為180501）溶液，按擬訂色譜條件分別于 0，1，2，4，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣量為10 μL，記錄色譜峰面積。結(jié)果見表2，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批蒲黃藥材（批號(hào)為180501），依法制備供試品溶液，平行6份，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見表2，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱取已知含量的蒲黃藥材（批號(hào)為 180501）粉末 0.50 g，平行制備 6份供試品；分別精密吸取槲皮素貯備液3 mL，置10 mL容量瓶中（每1 mL含槲皮素0.1214 mg）作為待加溶液，分別精密量取上述槲皮素待加對(duì)照品溶液1 mL，山柰素對(duì)照品貯備液1 mL，異鼠李素對(duì)照品貯備溶液3 mL，加入6份供試品中，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別計(jì)算回收率。結(jié)果見表3。

2.4 樣品含量測(cè)定

取上述不同產(chǎn)地的樣品，依法制備供試品溶液并測(cè)定，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量（以干燥品計(jì)）。結(jié)果見表4。

3 討論

按《中國藥典（一部）》蒲黃含量測(cè)定的取樣量進(jìn)行考察，分別取樣 0.5，1.0，2.0 g。當(dāng)取樣量少時(shí)，色譜峰面積較小，基線噪音干擾較大；取樣量太大，則對(duì)照品稱樣需要增大，易造成對(duì)照品浪費(fèi)。故選擇1.0 g作為取樣量。參照銀杏葉中3種黃酮苷的測(cè)定方法對(duì)供試品溶液的制備方法進(jìn)行考察，考察了鹽酸的不同比例（甲醇-10%鹽酸溶液、甲醇-25%鹽酸溶液、甲醇-35%鹽酸溶液）、不同提取方式（超聲、回流、索氏提取）、不同提取時(shí)間（30，60，90 min）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇和鹽酸的用量對(duì)3種黃酮苷元的含量影響很大。鹽酸濃度低，水解不完全，提取率低；鹽酸濃度大，對(duì)液相色譜的管路有腐蝕作用，同時(shí)酸濃度過大對(duì)色譜柱的要求較高，影響其適用性。綜合考慮，采用25%鹽酸溶液進(jìn)行水解，同時(shí)對(duì)甲醇 -25%鹽酸溶液不同體積比（1 ∶1，2 ∶1，4 ∶1，8 ∶1，10 ∶1，V/V）進(jìn)行考察，結(jié)果甲醇 -25%鹽酸溶液（4 ∶1，V/V）提取效率最高，回流和索氏提取效率基本一致，均高于超聲，由于回流方法簡(jiǎn)單，故采用回流提取。提取時(shí)間在60 min以后含量基本不變，故采用提取時(shí)間為60 min，綜合考慮選擇甲醇 -25%鹽酸溶液（4 ∶1，V/V），回流提取60 min作為供試品溶液的制備方法。

表33種黃酮苷元的加樣回收結(jié)果（n=6）

表4 不同產(chǎn)地蒲黃藥材中3種黃酮苷含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=2）

參考2015年版《中國藥典（一部）》銀杏葉藥材及其制劑［13］項(xiàng)下含量測(cè)定條件，對(duì)色譜條件中的流動(dòng)相和檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了考察，采用DAD檢測(cè)器在200～400 nm波長(zhǎng)內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，分別結(jié)合槲皮素、山柰素和異鼠李素3種對(duì)照品的光譜圖進(jìn)行比較，最后選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。考察流動(dòng)相的組分，分別以甲醇-0.4%磷酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液、乙腈-水和甲醇-水作為流動(dòng)相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇-水和乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)，異鼠李素的峰均有拖尾現(xiàn)象，對(duì)稱因子較低，而采用甲醇-0.4%磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，供試品中3種成分的色譜法峰形良好，基線平穩(wěn)，對(duì)稱因子為0.95～1.05內(nèi)，理論板數(shù)高，陰性對(duì)照無干擾。故確定甲醇-0.4%磷酸溶液為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm，與《中國藥典（一部）》中銀杏葉項(xiàng)下色譜條件一致。

本研究結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地的蒲黃藥材中3種黃酮苷的含量差異較大，廣西桂林產(chǎn)的蒲黃藥材中3種黃酮苷類成分含量最高，槲皮素為0.3721 mg/g，山柰素為0.4173 mg/g，異鼠李素為 1.7028 mg/g，這可能與當(dāng)?shù)貧夂蚝蜕L(zhǎng)環(huán)境有關(guān)。蒲黃多生長(zhǎng)在沼澤湖泊周圍等水量充足的地方，寧夏固原產(chǎn)和內(nèi)蒙古包頭產(chǎn)的蒲黃藥材中3種黃酮苷元成分含量最低，可能與當(dāng)?shù)亟涤炅可儆嘘P(guān)。可見，不同產(chǎn)地蒲黃藥材中3種黃酮苷類成分差異較大，故建議增加黃酮苷類化合物作為蒲黃藥材的質(zhì)控指標(biāo)。不同產(chǎn)地蒲黃藥材對(duì)其臨床使用具有一定影響，臨床使用蒲黃藥材應(yīng)多采購廣西、江蘇、湖北等地的，可保證藥效的最大限度發(fā)揮，同時(shí)為開發(fā)和利用蒲黃藥材的藥用價(jià)值提供參考。