大鼠體內白藜蘆醇膠束的藥代動力學研究*

張純剛，于琛琛，康 寧，唐靜雅

（1.遼寧中醫藥大學，遼寧 大連 116600； 2.大連醫科大學附屬第一醫院藥劑科，遼寧 大連 116011）

白藜蘆醇（RESV）是天然的非黃酮類多酚化合物，主要來源于葡萄、花生、桑椹等，是腫瘤的化學預防劑［1］，也是降低血小板聚集，預防和治療動脈粥樣硬化、心腦血管疾病的化學預防劑［2］，廣泛應用于保健品、醫藥和食品等領域。其水溶性低、穩定性差，生物利用度低，在光、熱和氧化劑條件下不穩定，易被氧化降解，在一定程度上限制了其應用［3］。因此，開發安全性高、穩定性好的新劑型來提高白藜蘆醇的穩定性、水溶性和生物利用度，具有重要臨床意義［4］。因其低溶解度、高滲透性，按生物藥劑學分類為Ⅱ類化合物，其生物利用度主要取決于體外溶出速度［5］。膠束在溶液中，兩親性共聚物可自行組裝成特定的超分子有序聚集體，形成一種穩定、澄清的液體制劑，有助于增加藥物的溶解度，提高生物利用度。本研究中根據白藜蘆醇的性質和疏水特性，以泊洛沙姆188為載體，將其制成膠束，以提高白藜蘆醇的水溶性、穩定性，并使其半衰期延長，提高生物利用度，擴大其臨床應用。并以原料藥為參比制劑，探討白藜蘆醇膠束在大鼠體內的藥代動力學過程?，F報道如下。

1 儀器、試藥與動物

儀器：島津LC-2010A型色譜儀（島津色譜工作站，UV檢測器）；AY220型電子分析天平（SHTMADZU公司）；TGL-16 g型高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；DAS 3.0軟件（中國藥理學會數學藥理專業委員會）；Vortex-5型渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

試藥：白藜蘆醇對照品（含量為98%，南京森貝伽生物科技有限公司，批號為111535-201502）；白藜蘆醇原料藥（武漢遠成賽創科技有限公司）；卡馬西平對照品（含量為99%，上海哈靈生物科技有限公司，批號為100142-201605）；白藜蘆醇膠束（自制）；乙腈（色譜純，天津科密歐科技有限公司）。

動物：取 SD 大鼠 12只，雄性，體質量為（250±20）g，由遼寧中醫藥大學實驗動物中心提供，動物使用許可證號為 SCXK（遼）2015-0001。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

取白藜蘆醇對照品10.2 mg，精密稱定，置250 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質量濃度為40.8 μg/mL的白藜蘆醇對照品貯備液。

精密稱取白藜蘆醇對照品10.0 mg，精密稱定，與上述同法操作，制成質量濃度為40.0 μg/mL的白藜蘆醇質量控制貯備液。

取卡馬西平對照品10.1 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得1.01 mg/mL卡馬西平貯備液。精密量取卡馬西平貯備液，加甲醇稀釋得質量濃度為25 μg/mL的內標溶液［6］。以上溶液均于4℃冰箱保存，備用。

2.2 色譜條件

色譜柱：AgilentExtendC18柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈 -水（30 ∶70，V/V）；流速：1.0 mL/min；進樣量：30 μL；檢測波長：320 nm；柱溫：室溫。

2.3 血漿樣品處理［6］

取血漿100 μL，置2 mL離心管中，依次加入10 μL甲醇，10 μL 內標溶液，50 μL 0.5% 醋酸，200 μL 乙腈，渦旋混合 60 s，離心 10 min（12000 r/min），取 100 μL上清液置進樣容器中，取30 μL進樣分析。

2.4 方法學考察

專屬性考察：分別取6只大鼠空白血漿，除以甲醇（內標溶液的溶劑）替代內標溶液外，其余按2.3項下方法操作，得大鼠空白血漿樣品色譜圖（圖1 A）；另取空白血漿、白藜蘆醇樣品和內標，及第1只大鼠單次給藥后0.5 h的血漿樣品，按2.3項下方法操作，得模擬樣品及實際樣品色譜圖（圖1 B和圖1 C）。結果白藜蘆醇的保留時間為3.86 min，內標的保留時間為7.25 min，空白血漿中的內源性物質和代謝物不干擾白藜蘆醇樣品和內標（卡馬西平）的測定。

標準曲線考察和定量限確定：取標準貯備液適量，加空白血漿稀釋成質量濃度為 10，20，51，102，204，510，1020，2550 ng/mL 的系列血漿樣品，其余按 2.3項下方法操作，同一質量濃度進行雙樣本分析，記錄色譜圖。以血漿中待測物濃度（C，ng/mL）為橫坐標、待測物與內標物的峰面積比值（A）為縱坐標，采用加權最小二乘法進行回歸運算，得直線回歸方程［7］。結果白藜蘆醇質量濃度在10～2550 ng/mL范圍內與峰面積線性關系良好，血漿樣品的典型標準曲線回歸方程為Y=0.0057X+0.1068，r=0.9982（n=8），最低定量限（LLOQ）為質量濃度10 ng/mL，可滿足SD大鼠體內白藜蘆醇測定的要求。

精密度和準確度試驗：精密量取質量控制貯備液適量，加空白血漿稀釋成質量濃度為低、中、高質量濃度（25，400，2040 ng/mL）的質量控制（QC）樣品溶液各 6份，連續測定3 d，除少加甲醇10 μL外，其余按2.3項下方法操作，分別考察日內和日間精密度。結果見表1?？梢?，方法的準確度與精密度均符合生物樣品分析的要求。

表1 大鼠血漿中白藜蘆醇的準確度和精密度試驗結果

提取回收率：取空白血漿100 μL，加入白藜蘆醇系列質量控制溶液10 μL，配制白藜蘆醇低、中、高質量濃度（25，400，2040 ng/mL）的 QC 樣品溶液，除少加甲醇10 μL外，其余按2.3項下方法操作，每一質量濃度進行6樣本檢測，得白藜蘆醇相應峰面積，記為A；同時，另取6只大鼠的空白血漿100 μL，除以甲醇10 μL代替相應內標卡馬西平的體積外，其余按2.3項下方法操作，再加入相應濃度和體積的白藜蘆醇標準溶液和內標溶液，渦流混合，進樣分析，每個質量濃度進行3樣本分析，得白藜蘆醇相應峰面積，記為B。以A與B的平均值計算白藜蘆醇的提取回收率，白藜蘆醇在3個質量濃度的血漿樣品提取回收率分別為98.13%，97.59%，104.22% （n=3）。依法測得內標的提取回收率為101.19%，RSD均在 ±15%以內（n=3）。

圖1 血漿中白藜蘆醇和卡馬西平的典型高效液相色譜圖

穩定性試驗：精密量取質控貯備液適量，用空白血漿稀釋成低、中、高質量濃度（25，400，2040 ng/mL）的質量控制樣品溶液，分別考察白藜蘆醇血漿樣品在室溫放置2 h、白藜蘆醇血漿樣品經沉淀蛋白后進樣室溫（4℃）放置24 h、白蘆藜醇血漿樣品-20℃經歷3次冷凍-解凍循環和-20℃冰凍30 d的穩定性（相對偏差均在±15%內）。3個質量濃度未處理，于室溫放置2 h測定含量準確率（RE% ）分別為 5.43% ，8.69% ，-5.50%；白藜蘆醇血漿樣品經沉淀蛋白后于室溫（4℃）放置 24 h測得含量 RE%分別為 3.13%，-4.91%，1.04%；反復凍融3次測得含量RE%分別為3.42%，-1.51%，2.89%；-20℃冰凍30 d的穩定性測得含量RE% 分別為 1.20% ，-6.68% ，3.39%（RSD均在 ±15%內，n=3）。結果表明，白藜蘆醇血漿樣品在上述條件下穩定性符合要求。

2.5 分析方法在藥代動力學中的應用

2.5.1 給藥方案與樣品采集

取雄性SD大鼠12只，隨機分為A組和B組，各6只。實驗前禁食12 h，自由飲水，次日晨，A組灌胃白藜蘆醇膠束（20 mg/kg），B組灌胃白藜蘆醇原料藥（20 mg/kg）。分別于給藥前（0 h）和給藥后 0.083，0.167，0.25，0.33，0.5，0.75，1，1.5，2，4，6，8，12 h 于眼底靜脈叢采血約200 μL，置預先標記好的肝素鈉抗凝管中，4000 r/min離心3 min，分離上層血漿，血漿樣品置-20℃冰箱保存，待測。

2.5.2 統計學處理

2.5.3 藥代動力學研究

實際生物樣品測定過程中，同時配制低（25 ng/mL）、中（400 ng/mL）和高（2040 ng/mL）質量濃度的 QC 樣品，根據當日標準曲線計算未知樣品和QC樣品濃度。經測定，12只大鼠分別口服白藜蘆醇膠束和原料藥后獲得平均血漿藥物質量濃度-時間曲線見圖2，主要藥代動力學參數見表2。

圖2 白藜蘆醇在大鼠體內的平均血漿藥物濃度-時間曲線對比圖

表2 大鼠體內白藜蘆醇主要藥代動力學參數比較（± s，n=6）

表2 大鼠體內白藜蘆醇主要藥代動力學參數比較（± s，n=6）

注：與白藜蘆醇組比較，aP＜0.05，AUC0-12為 0-12 h下藥 -時曲線下面積；t1/2為生物半衰期；Tmax為達峰時間；Cmax為最大血藥濃度。

參數AUC0-12 ［ng/（mL/h）］AUC0- ∞ ［ng/（mL/h）］t1/2（h）Tmax（h）Cmax（ng/mL）白藜蘆醇組514.7 ± 117.5543.7 ± 102.22.6 ± 2.00.16 ± 0.07473.3 ± 200.8白藜蘆醇膠束組814.5 ± 174.4a 851.0 ± 226.2a 1.5 ± 0.8a 0.19 ± 0.31082.9 ± 563.6a

大鼠分別灌胃白藜蘆醇原料藥及白藜蘆醇膠束后，白藜蘆醇分別在5 min和15 min左右血藥濃度達峰，說明白藜蘆醇膠束在大鼠體內迅速吸收入血。RESV原料藥組最大血藥濃度（Cmax）為（473.3 ±200.8）ng/mL，白藜蘆醇膠束組為（1082.9 ±563.6）ng/mL，提高了 2 倍多（P＜0.05）。與原料藥組相比，膠束組可較快達到有效濃度。與白藜蘆醇原料藥組相比，白藜蘆醇膠束組0～12 h內藥-時曲線下面積（AUC0-12）是白藜蘆醇原料藥組的 1.58倍（P＜0.05），即白藜蘆醇組和相對生物利用度為158%。

3 討論

本研究中采用熱熔擠出制劑法制備由功能性輔料泊洛沙姆188與白藜蘆醇組成的藥物制劑，優于傳統固體分散體。以泊洛沙姆188為載體將白藜蘆醇制成膠束后能顯著提高白藜蘆醇在大鼠體內的生物利用度。

口服制劑出現雙峰的可能原因如下。1）由于胃按一定時間排空，藥物分成2次達到小腸，造成藥物先后入血，出現雙峰；2）藥物在胃腸道的2個部位吸收，有快有慢，因而出現雙峰；3）肝-腸循環即經膽汁或部分經膽汁排入腸道的藥物，在腸道中又重新被吸收，經門靜脈又返回肝臟；4）制劑原因，如含有速釋成分和緩釋成分；5）脂溶性藥物吸收后，迅速分布到組織中，在血液中藥物代謝到一定程度后，又出現二次入血［8］。由于原料藥組并未出現雙峰現象，僅白藜蘆醇膠束組出現雙峰現象，故可排除機體本身的因素，如吸收部位和肝腸循環。故考慮制劑的原因可能性較大。此制劑又并未含有速釋和緩釋雙成分，即排除此因素。白藜蘆醇膠束組出現雙峰現象的原因可能為膠束在胃中析出，排空進入腸中后再次被吸收［7-8］，待進一步研究。