RNA恒溫擴增法與PCR-熒光探針法在含結核菌菌量較少標本中檢出率的比較

秦萬 王瓊 王明棟 張娟 徐勇 周偉才

(貴陽市公共衛生救治中心檢驗科，貴州 貴陽 550006)

結核分枝桿菌是人類結核病的病原體，目前結核病是全球尤其是發展中國家危害最為嚴重的慢性傳染病之一，據WHO統計，目前全世界20億人感染結核，每年新發病例890萬，死亡160萬[1]。近年來我國肺結核的發病率和死亡人數在27種法定報告傳染病中排第一位，每年死于結核病的人數約為25萬人[2]。因隨著實驗檢測技術的不斷發展，結核分枝桿菌的檢測方法有很多，特別是聯合檢測對結核病的診斷方法進行互補，可提高結核病的診斷和檢出率。本文主要介紹RNA恒溫擴增法與PCR熒光探針法對含菌量較少的標本和各類標本進行聯合檢測的對比及臨床應用。

1 資料與方法

1.1標本來源 2017年7月至2018年7月來本院就診且確診結核患者163例胸腹水、腦脊液作為實驗對象(胸水：81例、腹水：12例、腦脊液：70例)，2018年6月來本院就診和住院確診的282例患者各類標本(痰夜、纖刷物、膿分泌物等)進行檢測。結核病的診斷標準參照文獻[3]或《結核病治療指南》第四版[4]標準。120例對照組均診斷為其它呼吸疾病，且為同一份標本同時做RNA和DNA提取，男263例，女129例，年齡9個月～79歲，平均56歲。

1.2試劑與儀器 PCR-熒光探針法分枝桿菌核酸檢測試劑盒由博奧生物有限公司生產提供，儀器：ABI 7300 PCR儀由ABI公司生產提供。RNA恒溫擴增法結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒由上海仁度生物科技有限公司生產提供，儀器：TL988-Ⅳ實時熒光定量PCR儀由西安天隆科技有限公司提供。

1.3方法 收集胸腹水、腦脊液于無菌管中，再以4%NaOH液化液按1∶2比例進行液化(若較濃的標本則應多加液化液使其液化完全，腦脊液不需液化)。液化完全后。靜置15 min后對同一份標本再按PCR-熒光探針法與RNA恒溫擴增法的具體操作步驟進行。

1.4質量控制 RNA恒溫擴增法與PCR-熒光探針法檢測均嚴格實行區域化、無菌化、規范化，并由專人操作。RNA恒溫擴增法應用臨界弱陽性對照進行實驗室質控，為了防止出現漏檢(假陰性)的情況，SAT檢測實驗室應定期應用臨界弱陽性對照進行室內質量控制。臨界弱陽性對照的準備：將TB陽性對照用TB稀釋液稀釋10 000倍，即為臨界弱陽性對照。臨界弱陽性對照的使用方法：取50 μL臨界弱陽性對照，放入超聲波破碎儀中超聲處理15 min，超聲功率為300 W；樣本處理和檢測過程同陽性對照和陰性對照。所設置陽性對照、臨界弱陽性對照和陰性對照的dt值應滿足以下條件：陽性對照dt≤臨界弱陽性對照dt≤35，陰性對照dt無數值或為40；否則實驗視為無效，需重新進行[dt表示樣本曲線與閾值線交點的橫坐標讀數(與一般實時熒光PCR實驗結果的CT值類似)]。檢測結果的解釋：(1)閾值設定，以閾值線剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點。(2)質量控制，陽性對照dt≤35；陰性對照dt無數值或為40。(3)結果判斷，首先陰陽對照dt值滿足質量控制要求，否則實驗視為無效，需重新進行。dt≤35的樣本為陽性;3536或無任何數值(視儀器而定)。正常陽性對照品：擴增呈S型曲線，且Ct值<36；

1.5統計學方法 計數資料用兩個總體率和多個總體率χ2的檢驗，以P<0.05為差異有統計意義。

2 結 果

163例患者胸腹水、腦脊液檢測為：RNA恒溫擴增法為134例(82.21%)，PCR-熒光探針法為82例(50.31%)，RNA恒溫擴增與PCR-熒光探針均檢出陽性為53例(32.52%)三者比較有差異有統計學意義(P<0.05)；對照組無統計學意義，特異性100%。見表1。2018年6月282例各類標本檢測的結果顯示，兩種檢測方法比較無統計學意義，而三者比較均有差異統計學意義。見表2。

表1 TB-SAT檢測與PCR-熒光探針法對同一份標本檢測結果比較[n(%)]

表2 各類標本檢測結果比較(n，%)

注：均對同一份標本檢測。

3 討 論

SAT檢測技術的優點在于恒溫42℃擴增、起始靶標及擴增產物都是RNA，RNA定量檢測可直接反映檢測標本活菌的存在與否[5]。但其降解很快，如遇到可疑的標本需復查時檢出的可能就比較小。從以上檢測數據可知，該檢測技術的靈敏度比較高。具有關文獻報道，通過檢測幾種牛乳中結核分枝桿菌的方法，結果顯示為：SAT檢測法的檢測限為3CFU/mL，LAMP檢測法是3×101CFU/mL，PCR檢測是3×104CFU/mL，羅氏培養的檢測限是3×105CFU/mL，涂片染色的檢測限為3×108/mL[6]。所以從理論上或是從以上實際檢出的數據都也證明了SAT的檢測靈敏度都高于PCR-熒光探針法，特別是針對含菌量較少的標本其他方法無法檢出時，SAT的開展就顯得尤為重要。

SAT與PCR同時對同一份標本檢測的優點不但能提高檢出率，而且還能起到互補的作用，比如對含菌量特別少的腦脊液，標本來源不易，如果PCR無法檢出時，SAT的檢測就很必要，通過一年多實驗開展以來，更加證明了其靈敏度和特異性，與臨床診斷基本吻合，不足之處就是對死菌無法檢出，而PCR則可互補一下SAT的不足之處，但靈敏度不如SAT。

本文結果顯示(表2)，PCR的總的檢出率與SAT檢出率均無統計學意義；但對含菌量較少的胸腹水、腦脊液的可疑標本的檢出率差異有統計學意義，且SAT檢出率遠高于PCR(表1)。分析原因可能是含雜質較多的標本對結核菌分解破壞或干擾、以及留取時間過長導致結核菌死亡，而導致SAT檢出率受限；胸腹水、腦脊液里面可能含有維持結核菌存活的蛋白等其它營養物質，故導致這樣的現象發生。這也說明了如果正確留取保存標本的情況下SAT的檢出率是會高于PCR-熒光探針法的。試驗要求較熒光PCR擴增法低[7]。

本文結果顯示(表1)，對含菌量較少的標本胸腹水、腦脊液可看出，SAT的檢出率比PCR-熒光探針法要高，除了腹水及對照組外，其余檢出率的統計結果均有統計學意義，這可能是由于腹水的標本例數較少，無法在統計學上體現，但從檢出率的幾例來看SAT的檢出率仍高于PCR探針法的，但如果繼續統計，差異很有可能具有統計學意義。而對照組則是由體檢者或排除結核患者的其他呼吸疾病的患者，用兩種方法同時進行檢測，其結果均為陰性，即特異性均為100%，這就進一步說明如果嚴格按照兩者操作步驟進行操作，是可以避免假陽性的發生。

本次對445例結核患者進行了臨床走訪，結果顯示實驗室檢測出的結果完全符合臨床診斷的。SAT的開展在我院屬于新開展的項目，預期的效果也得到了廣大臨床醫生的認可，特別是對含菌量較少的腦脊液標本的檢測更具臨床應用價值，對于確診患者的檢出率達到了90%以上，證明了其推廣的臨床價值，給患者和臨床醫生提供了良好的診斷手段，結核性腦膜炎確診需要細菌學依據，目前認為腦脊液培養陽性率30%～40%[8]，關鍵是培養時間過長，不利于對腦膜炎結核病的診斷和治療。而且結核性腦膜炎的臨床特點與實驗室診斷因早期癥狀不典型及缺少有效的輔助檢查，易被誤診誤治[9]。故SAT的開展就臨床而言顯得更加有臨床應用價值，與此同時，其優點還在于：TB-SAT檢測與其他方法相比具備了快速、方便、敏感度、特異度高等優點，減少了污染的幾率，該方法可以成為肺結核臨床診斷及鑒別診斷的重要依據[10]。