EBV相關性噬血細胞綜合征患兒外周血Th17與Treg細胞的變化及意義

彭艷輝 鄧莉莉 周云

(郴州市第一人民醫院北院(兒童醫院)血液科，湖南 郴州 423000)

噬血細胞性淋巴組織細胞增生癥(hemophagocytic lymphohistipcytosis，HLH)又稱噬血細胞綜合征(hemophagocytic syndrome，HPS)，于1979年首先由Risdall等報告它是以全血細胞減少、發熱、肝脾腫大、高甘油三酯血癥和或(低纖維蛋白原血癥)、鐵蛋白異常升高、骨髓、淋巴結、肝脾出現噬血現象等為臨床特征的一類綜合征。它起病急、病情進展快、病死率高，嚴重威脅到患兒生命。該病分為兩種類型：原發性(或遺傳性)HLH和繼發性HLH。EBV-HLH是繼發性HLH中最常見的類型。EBV-HLH預后較差，病死率超過50%[1]。研究[2]表明，輔助 T 細胞/調節性 T 細胞(Treg)調節失衡可能與HPS的發生、發展有關。輔助T細胞 17(Th17)是2005年新發現的一類屬于CD4+T細胞亞群的細胞類型，主要分泌促炎因子IL-17、IL-22[3]。Treg細胞是一類具有維持免疫耐受、抑制T細胞過度活化的雙重作用的T細胞亞群。Foxp3(Forkhead boxp3，Foxp3)-叉頭樣轉錄因子家族的一員，是Treg 最特異性分子標記，CD4+Foxp3+的 T 細胞可作為 Treg的生物指標[4]。目前已有研究證實Th-17 / Treg 細胞的穩態在維持正常免疫應答和防止自身免疫性疾病中發揮了關鍵性的作用，但該穩態與EBV相關性HPS發生發展的關系尚未報道。本文從細胞水平及分子水平檢測了HPS 患兒Th17細胞和調節性T細胞(Treg)量的變化，初步探討了Th17/Treg失衡在EBV相關性HPS中發病及臨床療效評估中的作用。

1 資料與方法

1.1資料來源 選擇2015年9月至2017年12月郴州市人民醫院北院(兒童醫院)血液科收治的62例確診為EBV相關性HPS患兒為治療組，其中男34例，女28例，年齡8個月至9歲，平均(6.52±2.44)歲；血清EB病毒DNA拷貝數平均為(5.56±1.48)×105拷貝數/mL。初治組1例死亡，3例治療未緩解，其余58例為治療緩解組。緩解組血清EB病毒DNA拷貝數(2.76±3.48)×103拷貝數/mL。作為對照，選取本院同期門診體檢健康兒童60例為健康對照組，男32 例，女28例，年齡8個月至10歲，平均(6.87±2.35)歲。對照組及治療組(初治組、緩解組)年齡及性別差異無統計學意義(P>0.05)。診斷標準：(1)滿足下列8條中的5條：①發熱；②脾大；③血細胞減少(外周血三系或兩系減少)：Hb<90g/L(低于4周的嬰幼兒Hb<100 g/L)，血小板<100×109/L，ANC<1.0×109/L；④高甘油三酯血癥和(或)低纖維蛋白原血癥；空腹TG≥3.0 mmol/L，Fib≤1.5 g/L；⑤骨髓、脾臟或淋巴結中有噬血證據，無惡性腫瘤證據；⑥NK細胞活性降低或缺乏；⑦血清鐵蛋白≥500 μg/L；⑧可溶性CD25≥2 400 U/mL；(2)EBV感染的證據：滿足下列2條之一，①血清學抗體檢測提示原發性急性EBV感染；②分子生物學方法從患者血清、骨髓、淋巴結等受累組織中檢測EBV陽性。納入標準：(1)所有入選對象年齡≤14歲；(2)診斷符合EBV相關性噬血細胞綜合征。(3)患兒監護人均被告知噬血細胞綜合征的化療方案，并簽署知情同意書。提交醫院倫理學委員會審核批準。排除標準：心肝肺腎功能疾??；惡性腫瘤；先天免疫性疾病及代謝性疾病、原發性HLH。

1.2方法

1.2.1外周血Th17細胞百分比檢測 采集初治組、治療組及對照組清晨空腹靜脈血各2mL，采用密度梯度離心法獲得外周血單一核細胞(PBMCs)，加入等體積RPMI 1640培養液中，與佛波酯和離子霉素在37 ℃含5% CO2培養箱共培養5 h，PBS緩沖液洗滌細胞后棄上清。向管中加入CD3 PE-Cy5、CD8α FITC、IL-17 PE室溫下避光反應孵育30 min。加入固定劑100 μL，孵育后再加入破膜劑A 100 μL室溫孵育15 min，PBS洗滌1次后離心收集細胞，加入破膜劑B 100 μL，管中加入IL-17抗體，對應的對照管中加入同等μg數的同型對照，混勻，室溫孵育20 min，PBS洗滌后將細胞重懸于500 μL PBS液中，隨后以在FACS CantoⅡ流式細胞儀檢測。

1.2.2外周血Treg細胞檢測 采集HPS 初治組、治療組及對照組清晨空腹6點 EDTA 抗凝靜脈血1 000 μL加入流式專用試管，分別加入CD4-FITC、CD25-PE、CD127-PE-CY5單克隆抗體各10 μL 混勻，暗室孵育20 min，加入溶血素1 mL，充分混勻，加2 mL PBS緩沖液，以1 500 r/min 離心5 min，棄上清，加入500 μL PBS 緩沖液重懸細胞后，立即以FACS CantoⅡ 流式細胞儀檢測，分析軟件進行分析。

1.2.3外周血Foxp3 mRNA 表達的檢測 淋巴細胞分離液分離外周血淋巴細胞，Trizol一步法提取總RNA，反轉錄cDNA及行RT-PCR檢測 Treg 表達叉頭翼狀螺旋轉錄因子(Foxp3)mRNA(CD4CD25+Foxp3+Treg 轉錄因子)、Th17 表達孤核受體(RORγt)mRNA水平表達。表1列舉了基因引物序列、擴增產物長度。采用標準曲線法計算mRNA相對表達量(β-actin校正值)。引物由上海生工合成。

表1 基因引物序列及擴增產物長度

2 結 果

2.1初治組和對照組外周血Th17細胞及Treg細胞百分率比較 初治組Th17細胞百分率均明顯高于HPS對照組及緩解組，差異均有統計學意義(P<0.01)。外周血 Treg 細胞的百分率檢測 HPS 患兒初治組外周血 Treg 細胞的百分率明顯低于HPS對照組，差異亦有統計學意義(P<0.01)；治療后，緩解組Th17細胞百分率降低，與初治組相比差異有統計學意義(P<0.01)，但與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。而緩解組Treg 細胞升高，相對初治組差異有統計學意義(P<0.05)，但平均數值比對照組低，有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 HPS初治組、緩解組及對照組外周血Treg細胞及Th17細胞百分率的比較

注：初治組VS對照組，aP<0.01；緩解組VS初治組，bP<0.05；初治組VS對照組，cP<0.01；緩解組VS初治組，dP<0.01；對照組VS緩解組，eP<0.05；緩解組VS對照組，fP> 0.05。

2.2不同分組的外周血Foxp3mRNA、RORtmRNA的表達 HPS初治組外周血RORTmRNA的相對表達量顯著高于健康對照組，而HPS初治組外周血Foxp3mRNA的相對表達量顯著低于健康對照組，兩者差異均有統計學意義(均P<0.01)。而治療緩解組外周血RORtmRNA較初治組明顯下降，有統計學意義(P<0.01)，緩解組同對照組相比，無顯著差異(P>0.05)；治療緩解組外周血Foxp3mRNA較初治組明顯上升，有統計學意義(P<0.05)，但仍低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 HPS初治組、緩解組及對照組外周血RORtmRNA及Foxp3mRNA表達水平的比較

表3 HPS初治組、緩解組及對照組外周血RORtmRNA及Foxp3mRNA表達水平的比較

組別nFoxp3mRNAROR?tmRNA對照組601.18±0.21e0.99±0.18f治療組62初治組(n=4)0.33±0.12a2.89±0.36c緩解組(n=58)0.71±0.18b1.05±0.23d

注：初治組VS對照組，aP<0.01；緩解組VS初治組，bP<0.05；初治組VS對照組，cP<0.01；緩解組VS初治組，dP<0.01；對照組VS緩解組，eP<0.05；緩解組VS對照組，fP> 0.05。

3 討 論

HPS患者血細胞減少有多種因素參與：(1)噬血細胞增多，加速血細胞的破壞；(2)血清中存在造血祖細胞增殖的抑制性物質，骨髓內粒系和紅系前體細胞和巨核細胞進行性減少，歸因于抑制性單核因子和淋巴因子的產生，諸如γ-干擾素、腫瘤壞死因子(TNF)和白介素-1以及造血生長抑制因子的產生。研究[5]表明，Epstein-Barr病毒相關的HPS(EBV-HLH)被認為是繼發性HLH的主要亞型，在亞洲國家發病率較高，任何遺傳背景都可能影響繼發性HLH的發病。其病理生理機制為NK細胞/T淋巴細胞受到EBV感染后，出現功能缺陷，不能及時有效地清除受到感染的靶細胞，導致T淋巴細胞異常活化，使TNF-α、IFN-γ等細胞因子分泌水平增加，促使大量活化的T淋巴細胞和細胞因子，在機體內聚集，進而浸潤組織、損害臟器，形成HPS[6]。有研究[7]表明，T細胞亞群免疫功能紊亂在HLH發病中起著重要作用。但目前關于Th17/Treg失衡在EBV病毒相關性HPS的發生中研究甚少。

研究[8-10]證實，在炎癥或感染情況下，白細胞介素(IL)-6和TCFβ的刺激下，初始CD4+T淋巴細胞主要朝著Th17細胞分化，并主要分泌IL-17，IL-22等促炎癥因子，產生炎癥的放大效益。而當外源性抗原刺激后誘導產生的Treg細胞，可通過分泌IL-10等抑制性細胞因子發揮免疫抑制功能。故Th17/Treg失衡在自身免疫性疾病、炎癥性疾病、過敏反應等方面發揮舉足輕重的作用。本研究很好地揭示了EB病毒感染機體后，轉錄因子RORγtmRNA水平升高，從而促進了Th17細胞發育和促使其分泌特異性促炎因子IL-17，，進而導致其他炎癥因子的水平如 IL- 6、IL-1、TNF-α、粒細胞集落刺激因子及多種趨化因子等的提高，導致了炎癥瀑布式反應[11-12]并引起單核巨噬細胞增殖并且功能亢進，導致多臟器功能損害。本研究結果顯示，在治療緩解組中，Th17細胞百分比明顯下降，較初治組有統計學意義，與對照組無顯著差異。提示可能在EB病毒感染相關性噬血細胞綜合征治療過程中，監測Th17細胞百分比及相關炎癥細胞因子的水平變化對疾病療效的評判有重要的臨床意義。與研究[13-17]結果一致

我們還發現Treg細胞百分比及Foxp3mRNA相對表達量在EB病毒感染相關性HPS初治患者體內顯著下降，且按照噬血細胞綜合征指南治療后，治療緩解組Treg細胞百分比及Foxmp3mRNA水平明顯上升，但仍低于對照組。張茜[18]的臨床研究中提到，在機體免疫過程中，IL-6對Th17細胞與 Terg 細胞間平衡性具有關鍵性的調控作用，且其對初始CD4+T的分化方向具有決定作用，影響機體的免疫應答傾向，所以我們推測可能在EBV相關性HPS中，EBV靶細胞T淋巴細胞、NK細胞等功能缺陷，EB病毒清除障礙，某些炎癥因子促進了Th17細胞分化及發育，進一步產生炎癥級聯擴大效應，從而抑制了Treg細胞的產生，不能有效地發揮抑制T淋巴細胞過度活化的作用。本研究結果就提示了Treg細胞介導的免疫耐受在EBV相關性HPS的發生、發展中起著重要作用。同時在臨床中監測外周血Treg細胞數及相關細胞因子水平對臨床療效評估亦有重大的臨床意義。

綜上所述，在EBV相關性HPS發生和發展的多個環節，Th17/Treg細胞發揮了重要的作用，監測Treg細胞及Th17細胞百分比及相關細胞因子有效地調節機體的Treg 細胞及Th17細胞，可能為HPS臨床療效評判及干預治療提供新的思路。