初探流體切應力在肝癌細胞遷移中的作用

劉子逸 戴征偉 王利娟 閆志平 徐彬△

(1. 成都市第七中學高新校區，四川 成都 610041；2. 四川大學華西基礎醫學與法醫學院，四川 成都 610041)

腫瘤細胞的遷移和侵襲受到腫瘤組織所處腫瘤微環境的影響[1]。腫瘤微環境包括腫瘤周圍的組織、免疫細胞、血管、細胞外基質等多種成分[2,3]。力學微環境作為腫瘤微環境的重要組成部分，在調控腫瘤細胞的侵襲和轉移中發揮重要作用[4]。由于腫瘤組織中血管發育不良、內皮層不完善，使腫瘤細胞直接暴露于流動的組織間液中[5]。研究表明，腫瘤細胞受到的流體切應力大約為0.01～0.2 Pa[6]。

上皮-間充質轉化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是一種廣泛參與機體生理調節和病理性改變的重要機制[7]。腫瘤細胞發生EMT后，失去其上皮樣特征，而獲得間充質樣表型。EMT使細胞發生形態學和極性改變，細胞骨架發生重排，進而提升了腫瘤細胞的遷移能力[8-9]。緊密連接常見于上皮細胞中，主要起到固定細胞，輔助細胞極性，以及防止小分子穿越細胞間隙的作用[10]。緊密連接相關蛋白包括Claudin-5、Occludin、ZO-1等，這類蛋白表達的降低，代表著腫瘤上皮表型的失去，以及細胞間通透性的升高[11]。

本研究以肝癌HepG2細胞為研究對象，在體外培養條件下，利用平行平板流動腔提供穩定層流切應力，對HepG2細胞施加1.4 dyn·(cm2)-1流體切應力作用，研究流體切應力對肝癌HepG2細胞遷移能力的影響。在此基礎上，分析其細胞間緊密聯接的變化以及上皮、間充質標志物的變化，初步探討流體切應力誘導肝癌細胞遷移的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肝癌細胞株HepG2購自中科院生物化學與細胞生物學研究所，由四川大學華西醫學中心生物醫學工程實驗室保存；RPMI 1640細胞培養基、胎牛血清、胰蛋白酶購自Invitrogen公司；一抗(E-鈣粘蛋白，N-鈣粘蛋白)購自Sana Cruz公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔/鼠二抗、FITC標記熒光二抗購自中杉金橋公司；細胞核染料DAPI購自賽默飛公司；顯影液ECL plus購自碧云天公司。

1.2 細胞培養

HepG2細胞接種于含10%胎牛血清、鏈霉素(100 mg·(mL)-1)、青霉素(1×105U·L-1)的RPMI1640完全培養基中，并置于37℃恒溫、5%CO2含量孵箱中，飽和濕度，靜止條件下培養。待細胞長至80%～90%融合時，用0.25%胰酶消化后傳代再培養，細胞接種密度為2×105個·(mL)-1，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3 流體切應力加載實驗

實驗中的流體切應力由平行平板流動腔提供[12]。整個實驗裝置包括蠕動泵、儲液瓶、橡膠管道及單層流動腔。蠕動泵為實驗系統提供了穩定的定常流(Steady flow)，灌流液體為無血清RPMI1640(37℃時，粘度為0.83 mPa·s-1)。將HepG2細胞接種于75 mm×25 mm的載玻片上，待細胞融合至90%后，將玻片置于平行平板流動腔，并通過蠕動泵控制培養基的流速。加載切應力時，整個流場溫度保持37℃，緩沖體系可維持pH(7.2-7.4)。灌流系統的相關數據經前期計算并校正，實驗選取流體切應力為1.4 dyn·(cm2)-1。實驗分組按照切應力加載時間分為：靜態培養的對照組、加力2 h組、4 h組、8 h組以及先力學加載再力學松弛的8 h+4 h組和8 h+8 h組(即加載力8 h后再分別靜態培養4 h、8 h)。

1.4 劃痕實驗評估細胞遷移能力變化

對HepG2細胞加載1.4 dyn·(cm2)-1大小的流體切應力，分別作用2 h、4 h和8 h后，從平行平板流動腔取出玻片，行劃痕實驗，洗滌后置于培養皿中靜態培養，取培養0 h、4 h、8 h、12 h和24 h各時間點觀察細胞遷移情況，并與靜態培養的對照組比較。

1.5 免疫熒光法觀察細胞骨架F-actin變化

HepG2細胞不同組處理后，PBS漂洗2次·(5 min)-1，4%多聚甲醛固定，PBS漂洗3次·(5 min)-1孵育一抗(E-鈣粘蛋白，N-鈣粘蛋白)，4℃過夜。PBS漂洗3次·(5 min)-1，孵育熒光二抗，37℃、0.5 h，PBS漂洗3遍·(5 min)-1，37℃孵育DAPI 15 min。最后加入熒光封片劑，制片。樣品利用激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP5，Germany)觀察。

1.6 Western Blot測定相關蛋白表達變化

HepG2細胞不同組處理后，PIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑，磷酸酶抑制劑和PMSF)裂解細胞，收集蛋白。BCA定量后，加入上樣緩沖液，100℃變性8 min。經跑膠、轉膜后，5%脫脂奶粉封閉2 h，孵育一抗；4℃過夜。TBST漂洗3遍，孵育二抗；TBST漂洗3遍，加入ECL顯影液，凝膠成像系統觀察結果。用Image J分析蛋白條帶，用光密度比值代表蛋白的相對表達量。

1.7 透射電鏡觀察細胞間緊密連接的變化

PBS漂洗細胞，細胞刮子收集細胞入1.5 mL離心管中，用2000 r·(min)-1，離心15 min，棄上清。沿管壁緩慢加入0.5%戊二醛固定液，在4℃環境中靜置10 min。12000 r·(min)-1，離心15 min，棄上清。再沿壁緩慢加入3%戊二醛固定液。制作好細胞樣品，送至透射電鏡實驗室待檢。選取5000×倍數下的三張TEM圖片，計算細胞與細胞間緊密連接的距離。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 流體切應力對HepG2遷移的影響

對照組HepG2細胞遷移距離在8 h內無顯著性差異，12 h后遷移距離與0 h、4 h、8 h比較有統計學差異(P<0.05)。切應力作用2 h組與對照組相比，4 h時間點的遷移距離與2 h時間點比較即出現顯著的差異，時間越長，遷移距離遠大。加力4 h組及8 h組與對照組相比，在2 h時間點即發生明顯的遷移(P<0.05)，時間越長，遷移距離遠大。因此，流體切應力促進HepG2細胞遷移，遷移距離隨著切應力加載時間的延長而增大，見圖1。

2.2 流體切應力對HepG2細胞骨架F-actin的影響

流體切應力可誘導HepG2細胞骨架的重排，從而改變細胞形態，并促進了細胞的遷移。通過對F-actin染色發現(圖2)，對照組肝癌細胞呈現不規則的多邊形，細胞骨架未見明顯的絲狀結構。切應力加載后，細胞鋪展拉伸，呈長梭形，面積增加，并且在流體切應力方向上形成明顯的應力纖維。撤銷切應力4 h及8 h后，細胞應力纖維逐漸消失，但F-actin的排列仍保持規整。以上結果表明，流體切應力誘導HepG2骨架重排，有利于肝癌細胞的遷移。

圖2 流體切應力對HepG2細胞骨架F-actin的影響注：a：靜態對照組；b：2 h組；c：4 h組；d：8 h組；e：8h+4h組；f：8 h+8 h組圖中黃色和紅色箭頭分別表示細胞邊緣板狀偽足和絲狀偽足，白色箭頭代表流動方向(綠色：細胞骨架；藍色：細胞核)。

2.3 流體切應力對HepG2細胞上皮-間充質轉化關鍵蛋白表達的影響

上皮細胞的分子標志物表達下調與間質細胞的分子標志物表達上調是細胞發生EMT最顯著的標志。圖3描述了HepG2細胞加載流體切應力后，E-Cadherin和N-Cadherin表達的時序性變化規律。

從圖3a可見，靜態培養組E-Cadherin以及N-Cadherin主要分布在細胞膜周圍，隨著切應力加載時間的增加，E-Cadherin的表達強度呈降低的趨勢，而N-Cadherin的表達強度呈升高趨勢；加載流體切應力8 h后，對細胞靜態培養即力學松弛4 h以及8 h后觀察可見，E-Cadherin的表達強度有所恢復而N-Cadherin表達強度有所降低。

由圖3b可以看出，上皮標志物E-Cadherin在切應力作用2 h后表達下調至較低水平，并維持這種低水平至8 h，撤銷切應力后其表達水平顯著升高。但是，力學松弛8 h后其表達水平仍然顯著高于靜態培養組(P<0.05)。間充質標志物N-Cadherin在力學刺激2 h內其表達水平無明顯變化，隨著加力時間的延長其表達逐漸升高，到8 h時表達達到峰值，且與對照比較具有顯著性差異(P<0.05)。Vimentin在力學刺激2 h顯著上調，隨著切應力加載保持高水平表達，撤銷切應力后Vimentin的表達變化不明顯，這與圖2免疫熒光結果基本一致，即切應力使骨架重排后。撤銷力學加載4 h和8 h，細胞骨架結構依然保持規整的狀態。此外，間充質標志物Twist和Snail的表達規律基本一致，均在2 h內表達升高，8 h達到峰值，撤銷切應力后其表達逐漸降低并且低于對照組水平(P<0.05)。Western blot與免疫熒光結果的實驗結果基本一致，說明流體切應力能夠影響E-Cadherin以及N-Cadherin的表達，誘導肝癌細胞發生EMT，但EMT相關關鍵蛋白的表達存在時序差異性。

圖3 流體切應力對HepG2細胞上皮-間充質轉化關鍵蛋白表達的影響注：a：免疫熒光雙染分析切應力作用后，N-cadherin(紅色)及E-cadherin(綠色)分布的變化；藍色為細胞核，黃色箭頭所指為局部放大圖中觀察到的E-cadherin/N-cadherin熒光的分布和表達；b：切應力作用后，EMT標志蛋白表達水平的變化。

2.4 流體切應力對肝癌HepG2細胞間緊密連結的影響

圖4為1.4 dyn·(cm2)-1流體切應力作用不同時間對HepG2細胞間緊密連結的影響。由圖可知，對照組細胞間連接(黑色箭頭)完整，平均寬度約20±1.0 nm。加載切應力2 h后，細胞間的緊密連接出現破壞，細胞間連接不再完整，平均寬度增至28±6.5 nm。加載切應力4 h后，細胞間出現了更為明顯的空隙，細胞連接不完整，其平均寬度增加為135±13 nm，與對照組相比有明顯的差異(P<0.05)。加載切應力8 h后，細胞間的空隙進一步增大。撤銷切應力，細胞靜態培養4 h后觀察細胞間連接有所恢復，空隙明顯小于加力8 h后的空隙寬度，平均寬度為232.5±13.5 nm。撤銷切應力，細胞靜態培養8 h后，細胞間連接寬度繼續減小，其平均寬度為128±15 nm。因此，流體切應力誘導肝癌細胞緊密連接破壞，提高了連接空隙寬度，從而增大了肝癌細胞通透性，有利于細胞遷移。

圖4 流體切應力對肝癌HepG2細胞緊密連接的影響注：a：流體切應力作用對細胞緊密連接形態的影響(左圖5000×，右圖20000×)；b：流體切應力作用對細胞間緊密連接平均寬度的影響，*P<0.05表示差異有統計學意義。

3 討論

腫瘤的侵襲與轉移是造成癌癥患者治療失敗和高死亡率的主要原因。腫瘤的轉移是一個多步驟的過程，而EMT是腫瘤細胞脫離原發灶，進行局部浸潤或者沿血道和淋巴道轉移的先決條件[13]。在EMT發生過程中，腫瘤細胞失去上皮細胞的表型，如粘附分子的失去等，失去了與基底膜或其他細胞的連接，致使細胞去極化，細胞骨架重排[8]，從而獲得較高的遷移和侵襲能力，同時抗凋亡能力和降解細胞外基質的能力也同步增強[14]。

在當今腫瘤的研究領域，絕大多數研究關注于腫瘤微環境中的生物學因素和化學因素。而在腫瘤的發生發展過程中，腫瘤微環境的力學因素，包括流體切應力，基質硬度等均發生了較大的變化[15]，力學因素影響著腫瘤的發生和發展，而這一方面研究較少。我們利用蠕動泵和平板流動腔，在體外培養條件下，給予肝癌細胞HepG2流體切應力的刺激，研究切應力對肝癌細胞EMT和遷移的影響。我們的結果表明，切應力上調肝癌細胞間充質標志物，下調上皮標志物，誘導肝癌細胞EMT；切應力作用下，肝癌細胞胞間緊密連接的距離增加，肝癌細胞通透性增加；同時，切應力促進肝癌細胞遷移。我們的研究結果從細胞和分子層面證明，流體切應力是誘導肝癌細胞EMT和遷移的重要物理學因素，值的一提的是，有研究表明，肝癌組織內的細胞感受到比正常肝組織更大的流體切應力[5]，提示我們，在肝癌原發灶轉移的過程中，物理學因素，尤其是流體切應力的作用不可忽略。

因此，流體切應力誘導肝癌細胞EMT，提高肝癌細胞通透性，進而促進肝癌細胞遷移。本文初步研究了流體切應力誘導肝癌細胞遷移的分子機制，將有助加深人們于對腫瘤轉移的力學生物學機制的認識。