艾塞那肽微球在食蟹猴體內的免疫原性及藥代動力學比較研究*

李洪貞 夏艷 單佳妮 季杰

(1. 北京昭衍新藥研究中心股份有限公司，生物制品安全性評價北京市重點實驗室，北京 100176；2. 昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司，江蘇 蘇州 215421)

糖尿病是由多種病因所致的以慢性高血糖為特征的一類代謝性疾病，多因胰島素分泌缺陷或胰島素抵抗所致。隨著生活生平的不斷提高，肥胖率增加，糖尿病在全球范圍內的發病率持續增高[1,2]，且發病年齡有降低趨勢。其中2型糖尿病占糖尿病患病人數的90%以上，盡管患者體內產生胰島素的能力并非完全喪失，有的患者體內胰島素甚至產生過多，但胰島素的作用效果較差，因此患者體內的胰島素處于相對缺乏狀態。

胰高血糖素樣肽-1(Glucagon-like peptide-1, GLP-1)是由腸道分泌的一種腸促胰素[3]，具有葡萄糖依賴性促進胰島素分泌的能力，可通過多種機制有效降低2型糖尿病患者的血糖水平，同時亦可減輕患者體重、改善α和β細胞功能。GLP-1受體激動劑可通過與GLP-1受體結合，產生GLP-1受體激動后效應，與傳統口服降糖藥物相比，作用更為全面[4]。

艾塞那肽(Byetta，百泌達)是最早上市的GLP-1受體激動劑，于2009年經中國CFDA批準上市。該藥適用于二甲雙胍基礎上加用磺脲類和(或)噻唑烷二酮類藥物控制血糖仍不滿意的2型糖尿病患者，于每日早餐和晚餐前60 min內皮下注射。由于其半衰期短，需要每日2次注射。2012年1月，美國食品和藥品監督管理局批準了艾塞那肽注射液每周一次緩釋劑型的上市申請，這是2型糖尿病治療中首個每周使用一次的治療藥物，給藥時間的延長使得患者用藥更為方便，大大提高了患者的依從性[5]。

艾塞那肽緩釋制劑是將艾塞那肽分子分散到微球當中，通過皮下注射的方式進入體內后，微球粒子通過自發的水解作用，將有效成分緩慢吸收到體內循環當中。這一特點更有利藥物濃度長時間維持在有效的血藥濃度之上，更好的發揮藥理作用[6,7]。本實驗擬考察注射用艾塞那肽微球單次皮下注射給予食蟹猴的免疫原性及藥代特征，并與已上市藥物Bydureon比較，為后續研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品

受試物：注射用艾塞那肽微球，某藥廠提供，批號130205，白色至類白色粉末，2mg/支，2-8℃保存，有效期暫定至2014年2月。

市售品：注射用艾塞那肽微球(Bydureon)，Amylin生產，批號73177，白色至類白色粉末，2 mg/支，2-8℃保存，有效期至2014年4月。

1.2 主要試劑及試劑盒

艾塞那肽標準品：由某藥廠提供，批號121204，白色至類白色粉末，50 mg/支，艾塞那肽含量99.2%，-20℃以下保存，有效期暫定至2014年12月；Exendin-4檢測試劑盒(FEK-070-94)購于Phoenix Pharmaceuticals(美國)；抑肽酶(11583794001)購于Roche(美國)；HRP標記兔抗猴IgG抗體(A2054)購于Sigma(美國)；牛白蛋白(69003433)購于國藥集團化學試劑有限公司；TMB顯色底物(C09-555214)購于BD(美國)。

1.3 主要儀器

高速冷凍離心機(5810R)由Eppendorf生產，多功能酶標儀(Spectra Max M5)由Molecular Device生產，洗板機(ELx405 Select CW)由Biotek生產。

1.4 動物

普通級食蟹猴(購于廣西南寧市富澤野生動物養殖有限公司)16只，雌雄各半，體重范圍2.89～3.67 kg。動物群養于普通級動物房的不銹鋼籠內，每籠每性別不超過4只。每日上午和下午各喂食一次猴飼料，平均每只動物每次喂飼料約100 g左右，并輔喂水果或蔬菜50 g左右；動物自由飲水，飲用符合國家城市生活飲用水衛生標準的自來水。

本實驗的動物使用方法經昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司動物管理與使用委員會(IACUC)批準。IACUC批準編號為：ACU18-304。

1.5 方法

所有動物按性別隨機分成受試物組和市售品組，每組雌雄各4只。每瓶受試物/市售品凍干粉加入一瓶注射用艾塞那肽微球專用溶劑混勻，艾塞那肽濃度3.08 mg·mL-1，分別皮下注射給予動物0.14 mL·kg-1，給藥劑量0.44 mg·kg-1。

所有動物于給藥前、給藥后2、4、6、8、10 w，上肢或下肢靜脈采集全血約1.0 mL。分離血漿，采用ELISA法檢測特異性抗艾塞那肽IgG抗體，檢測方法：艾塞那肽標準品用碳酸鹽緩沖液稀釋至1 μg·mL-1包被至微孔板上，3%的BSA封閉后加入5倍梯度稀釋的血漿樣本，洗板后加入HRP標記兔抗猴IgG，加入TMB顯色底物，加入H2SO4終止后在450 nm處測定吸光度，以藥前值為對照，高于藥前值的1.5倍為抗體陽性。

各動物于給藥前(0 h)、給藥后0.5、1、3、6、12 h，1、2、3、5、7、10、14、17、21、24、28、31、35、38、42、45、49、52、56、63、70 d上或下肢靜脈采集全血約0.5 mL，放入預加5 μL肝素鈉(6250 IU·mL-1)和6 μL抑肽酶(50 TIU·mL-1)的離心管中(取血前，含有肝素鈉和抑肽酶的離心管于2～8℃或冰浴保存)，混勻分離血漿，離心條件為：1000 g，4℃，10 min，采用商品化的化學發光免疫試劑盒測定血漿中艾塞那肽濃度。

1.6 數據分析

采用WinNonlin(V6.2)軟件的非房室模型法(NCA)對代謝動力學參數進行計算，主要包括AUC、Cmax、Tmax等參數。利用Microsoft Office Excel計算均值，標準差，變異系數。

2 結果

2.1 抗艾塞那肽抗體

抗艾塞那肽抗體檢測結果顯示，給藥后2 w，受試物組一只雄性動物產生抗藥抗體(滴度1:25)，給藥后4 w受試物、市售品分別有4只、3只動物檢出抗藥抗體，至給藥后70 d(10 w)兩組各有7只動物檢出抗藥抗體，其中兩組動物分別有1只、2只動物抗體滴度超過1:125，其他抗體陽性動物的滴度介于1:5-1:125。表明單次皮下注射給予食蟹猴，受試物與市售品有相似的免疫原性，見表1。

2.2 血漿艾塞那肽濃度

給藥后受試物組及市售品組各動物平均血漿藥物-時間變化見圖1、圖2。

結果顯示，受試物皮下注射給予食蟹猴后，在給藥后的前6 h有一個初始釋放，此后藥物低濃度釋放，藥物的主要釋放在給藥后約10 d開始，并在第28 d左右達峰，持續至約42 d，至給藥后70 d，仍有5只動物血漿中可以檢測到藥物的存在。

市售品皮下注射給予食蟹猴后，在給藥后的前6個小時有一個初始釋放，此后藥物低濃度釋放，藥物的主要釋放在給藥后約10 d開始，并在第28 d左右達峰，持續至約45 d，至給藥后70 d，仍有7只動物血漿中可以檢測到藥物的存在。

表1 給藥后各動物抗艾塞那肽抗體產生情況

備注：“-”表示抗體測定結果陰性。

圖1 給藥后受試物組動物血漿藥物濃度-時間變化

圖2 給藥后市售品組動物血漿藥物濃度-時間變化

結合各動物抗體的產生情況，除受微球中艾塞那肽的釋放外，血漿藥物濃度及系統暴露量與抗艾塞那肽抗體的水平相關，較高滴度的抗體延緩藥物的清除。給藥后4 w供試品組12號動物抗藥抗體滴度為1:625，給藥后6 w升至1:3125。給藥后6w，對照品組15號動物抗體滴度1:625，給藥后8 w，13號動物抗體滴度為1:625，以上三只動物血藥濃度均受到明顯影響，高于同時間點其他動物；其余各組動物抗藥抗體滴度均≤1:125，除對照組14號動物外，均對血藥濃度影響不明顯，所以采用抗藥抗體滴度≤1:125為劃分標準(不包括14號動物)，進行比較分析，結果見圖3。

結果顯示，受試物及市售品單次皮下注射給予食蟹猴后，兩組動物血漿藥物濃度相當，且隨時間變化趨勢一致。

圖3 給藥后各組動物平均血漿藥物濃度-時間變化注：所有動物n=8；受試物組部分動物n=7；市售品組部分動物n=5。

2.3 代謝動力學參數

給藥后受試物、市售品組各動物體內代謝動力學參數見表2、表3。

結果表明，受試物、市售品單次皮下注射給予食蟹猴(0.44 mg·kg-1)后各組雌雄動物藥代動力學參數無顯著差異(P>0.05)，受試物與市售品間各藥代參數無顯著差異(P>0.05)，微球藥物釋放及藥代特征均一致。

2 討論

艾塞那肽是胰高血糖樣肽-1(GLP-1)的類似物，具有與GLP-1幾乎相同的生物學活性，但穩定性遠高于GLP-1。艾塞那肽不僅能夠促進胰島素合成和分泌，還能促進胰島細胞中胰島素基因轉錄以及增加靶組織對胰島素敏感性，但其促胰島素分泌作用依賴于高血糖濃度，血糖濃度較低時就不會增加胰島素分泌，從而避免低血糖發生。本實驗選用正常動物進行試驗，動物血糖水平較低，不足以使艾塞那肽促進胰島素的分泌，因此本實驗未觀察動物血糖水平變化。

表2 受試物單次皮下注射給予食蟹猴后藥代參數計算

注：Cmax,p表示給藥后至24 h血漿藥物峰濃度，Cmax,t表示至給藥后70天血漿藥物峰濃度；p表示不同性別間比較，p′表示與市售品組比較(所有動物)，student t test；“總體”表示包含該組所有動物，“部分”表示不包含12號動物。

表3 市售品單次皮下注射給予食蟹猴后藥代參數計算

注：Cmax,p表示給藥后至24 h血漿藥物峰濃度，Cmax,t表示至給藥后70天血漿藥物峰濃度；p表示不同性別間比較，student t test；“總體”表示包含該組所有動物，“部分”表示不包含13、14、15號動物。

對照品的臨床前研究資料[8]表明，單次皮下注射給藥后兩周，食蟹猴產生抗藥抗體，抗體不具有中和性，當抗體滴度高于1:125時，艾塞那肽的體內消除減慢，血漿暴露量增加，抗體滴度低于1:125時，除個別動物外，艾塞那肽的暴露量變化不明顯。

本實驗中，供試品和對照品組動物從給藥后2 w開始出現抗藥抗體，給藥后4w供試品組12號動物抗藥抗體滴度為1:625，給藥后6w升至1:3125；給藥后6w，對照品組15號動物抗體滴度1:625，給藥后8w，13號動物抗體滴度為1:625，以上三只動物血藥濃度均受到明顯影響，其余各組動物抗藥抗體滴度均≤1:125，除對照組14號動物外，均對血藥濃度影響不明顯，本試驗采用抗藥抗體滴度≤1:125為劃分標準(不包括14號動物)對結果進行分析。

試驗中，供試品組和市售對照品Bydureon在血藥濃度變化趨勢、AUC、Cmax及Tmax等方面均無顯著差異。但是，本試驗中動物暴露量(AUC、Cmax)相關參數與Bydureon在FDA綜述資料中公布的同等劑量對應參數有一定差異。由于本品血藥濃度受抗體滴度影響明顯，Bydureon藥代試驗使用動物較少，且個體差異大，抗體滴度范圍為1:5-1:3125，故而推測不同試驗之間的差異可能與本品的免疫原性相關。

另外，Bydureon和Byetta(百泌達)臨床研究中均發現抗艾塞那肽抗體的產生對血漿中艾塞那肽暴露量有一定影響，且不同的抗體滴度對艾塞那肽暴露量的影響不同。本試驗中供試品和Bydureon對照品給予食蟹猴后也發現了抗藥抗體存在，提示臨床研究中應關注本產品的免疫原性指標。