酶促制備EPA/DHA磷脂的研究進展

孫兆敏，蔡勝利

(威海博宇食品有限公司，山東 威海 264205)

以二十碳五烯酸(C20:5n-3,EPA)和二十二碳六烯酸(C22:6n-3,DHA)為代表的海洋n-3多不飽和脂肪酸已被證實具有多種對人體有益的生理功能。

目前常見的EPA和DHA產品主要是魚油和微藻油，其化學形式多為甘油酯或乙酯，其中甘油酯是EPA和DHA的天然存在形式之一，但兩種脂肪酸的總含量較低，乙酯產品是直接或間接以甘油酯型EPA和DHA為原料經酯交換反應制得的，可進一步通過分子蒸餾、尿素包合等技術手段大幅提高其EPA和DHA的含量，但乙酯型EPA/DHA在人體內的利用效率低，且存在一定的安全隱患。

近年來，磷脂型EPA/DHA(即EPA/DHA-磷脂，EPA/DHA-PL)因其在氧化穩(wěn)定性[1]、生物利用效率和營養(yǎng)功能等[2]方面的優(yōu)勢越來越受到關注。EPA/DHA-PL天然存在于海洋動物(如磷蝦、軟體動物、魚類等)和哺乳動物體內，而國內外以南極磷蝦、海魚卵等為原料提取EPA/DHA-PL的技術已經實現產業(yè)化。受限于海洋原料來源穩(wěn)定性、海洋過敏原以及重金屬、農藥污染等因素，國內外研究者在深入開發(fā)更安全、更高效和更低消耗的提取技術的同時，也將目光投向了EPA/DHA-PL的酶促制備技術。

根據反應類型的不同，EPA/DHA-PL酶促制備方法主要包括酯交換法、酯合成法和水解法，其中酯交換法可進一步細分為酸解法、醇解法和酯-酯交換法。而根據制備策略的不同，又可分為酰基替換法(包括酸解法和酯-酯交換法)、酰基結合法(主要是酯合成法)和酰基脫除法(包括水解法和小分子醇參與的醇解法)。本文中，筆者將根據制備策略的不同，對近年來酶促制備EPA/DHA-PL的研究進展進行綜述，以期為相關的研究人員提供借鑒。

1 酰基替換法

1.1 酰基替換法概述

酰基替換法是以大豆磷脂和蛋黃磷脂等幾乎不含EPA/DHA的磷脂為主要原料，通過酶促酸解或酯-酯交換反應，將磷脂中的其他脂肪酸替換為EPA/DHA的方法(圖1)。酰基替換法可選用的酶制劑種類多，反應底物易于混溶且對酶活力影響較小，是酶促制備EPA/DHA-PL的主要技術手段。早在1986年，Yoshimoto等[3]就開發(fā)了通過酸解反應制備EPA磷脂的技術。在國內，張苓花等[4]和王永華等[5]較早地開展了酰基替換法制備EPA/DHA-PL的研究。目前，評價酰基替換法效率的主要指標是EPA/DHA與磷脂的結合率以及最終產物得率，前者通常由反應一段時間內磷脂原料中EPA/DHA增加量來體現，后者主要受副反應(主要是水解反應)和產物提取方法的影響。

圖1 酰基替換法制備EPA/DHA-PLFig.1 Preparation of EPA/DHA-PL by acyl-replacement method

1.2 酶源及特點

以脂肪酶、磷脂酶A1和磷脂酶A2為催化劑制備EPA/DHA-PL的研究均有報道，在絕大部分研究中，酶制劑的篩選通常作為制備EPA/DHA-PL的第一步。Mutua等[6]通過正己烷體系中磷脂酰膽堿與EPA的酸解反應，比較了磷脂酶A2、磷脂酶A1和7種脂肪酶的催化效果，發(fā)現未經固定化的毛霉(Mucormiehei)脂肪酶和磷脂酶A2催化的反應中EPA結合率較高。而Marsaoui等[7]則從來源于南極假絲酵母(Candidaantarctica)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)、毛霉、疏棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosus)和米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)的6種脂肪酶中篩選出固定化米黑根毛霉脂肪酶(Lipozyme RM IM)用于催化正己烷體系中大豆磷脂與EPA/DHA乙酯的反應。

除了來源微生物的不同，同一種微生物產生的不同脂肪酶在催化磷脂酸解反應過程中也可能會獲得截然不同的結果，如Chojnacka等[8]選用的7種脂肪酶中，只有來源南極假絲酵母的脂肪酶B(CalB)可將蛋黃磷脂中的EPA和DHA含量提高到10%以上，而南極假絲酵母脂肪酶A(CalA)則幾乎無法催化蛋黃磷脂與EPA/DHA的酸解反應。通常認為，CalA是較少見的對甘油三酯sn-2位具有催化偏好性的脂肪酶，而CalB則不具有催化位點的偏好性。通過對磷脂產物的進一步分析，Chojnacka等[8]發(fā)現產物中DHA主要結合在磷脂甘油骨架的sn-1位上，這說明CalB在磷脂的酸解反應過程中表現出了sn-1位點的偏好性。類似地，褶皺假絲酵母(Candidarugosa)脂肪酶也通常不具有甘油三酯位點的偏好性，但在大豆磷脂和EPA/DHA乙酯的反應過程中卻表現出了sn-2位點的偏好性[9]。另外，柱狀假絲酵母(Candidacylindracea，又稱褶皺假絲酵母)脂肪酶[9-10]、米黑根毛霉脂肪酶[11-12]和疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶[13]等更易于催化EPA與磷脂的結合，而相對于EPA，Novozym 435則更傾向于催化DHA參與的反應，表現出對DHA的偏好性，且該偏好性不隨反應溶劑的不同而改變[8]。

Novozym 435是一種將CalB吸附在大孔丙烯酸樹脂上而制成的固定化脂肪酶，潘麗等[14]以其為工具酶催化大豆粉末磷脂的酸解反應，得到EPA和DHA含量為21.56%的磷脂，經進一步優(yōu)化反應條件，將磷脂中EPA和DHA總量提高到24.32%[15]。

磷脂酶A1和A2分別對磷脂甘油骨架上sn-1、sn-2位的脂肪酸具有專一性，也是酰基替換法制備EPA/DHA-PL的常用酶制劑。Kim等[16]用液體磷脂酶A1—— Lectitase ultra催化磷脂酰膽堿的酸解反應制備EPA/DHA-PL，反應24 h時，EPA/DHA與磷脂的結合率達到28%，其后該研究團隊將磷脂酶A1固定化并優(yōu)化反應條件，使結合率得以進一步提高[17]。另外國內的研究者也先后以固定化磷脂酶A1為催化劑對酰基替換法制備EPA/DHA-PL進行了研究[18-22]。普通磷脂可通過酰基替換法成為EPA/DHA-PL，實現“從無到有”的過程，一些本身富含EPA/DHA的磷脂，如南極磷蝦磷脂，也可以通過該方法進一步提高其EPA/DHA的含量，達到“從有到多”的效果。Xi等[22]從南極磷蝦中提取的磷脂中EPA和DHA的含量分別為23.2%和14.8%，且EPA和DHA主要位于磷脂的sn-2位上，通過磷脂酶A1的作用將sn-1位上的其他脂肪酸替換為EPA/DHA，可獲得EPA和DHA的含量分別為24.7%和59.0%的磷脂產品。

根據磷酸基團連接的取代基團不同，磷脂可分為磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和磷脂酰絲氨酸等。相對于其他種類的磷脂，磷脂酰膽堿更易于通過酸解反應與EPA/DHA結合[6,10,13,23]。而根據EPA/DHA供體化學形式的不同，酰基替換法分為酸解反應(磷脂與游離型EPA/DHA的反應)和酯-酯交換反應(磷脂與乙酯或甘油三酯型EPA/DHA等的反應)，Yamamoto等[9]以褶皺假絲酵母脂肪酶為催化劑，考察了3種不同形式的EPA/DHA供體參與的酯交換反應，結果發(fā)現甘油三酯和游離脂肪酸參與的反應具有更高的結合率。但Haraldsson等[12]研究發(fā)現，采用游離脂肪酸和乙酯作為的EPA/DHA供體形式最終反應結合率相差不大，但酯-酯交換反應過程中的水解副反應卻比酸解反應過程的劇烈，可能的原因是游離型EPA/DHA在一定程度上抑制了水解反應的發(fā)生。由于高含量EPA/DHA乙酯的制備工藝相對簡單，且氧化穩(wěn)定性較強，近年來有相當數量的研究通過酯-酯交換反應制備EPA/DHA-PL[7,9,20-21,24]。

1.3 酶促反應的溶劑體系

酰基替換法制備EPA/DHA-PL通常在非水反應體系尤其是無溶劑體系和有機溶劑體系中進行。

低極性的正己烷可較好地溶解磷脂和EPA/DHA供體，且能夠維持較高的脂肪酶活力，因此常用于EPA/DHA-PL的制備[6-8,25-26]，Chojnacka等[8]比較了不同有機溶劑對酸解反應結果的影響，發(fā)現采用正己烷獲得的EPA/DHA結合率最高(24%)、正庚烷次之(18%)、甲苯最低(12.3%)，而對磷脂酶A2催化的酯-酯交換反應來說，甲苯則是比正己烷或正庚烷更適宜的溶劑[27]。

無溶劑體系不使用易燃易爆且具有一定毒性的溶劑，避免了有機溶劑的“稀釋”作用，反應底物和酶的平均濃度高、反應初速度快、產物分離步驟簡單，可能是制備EPA/DHA-PL的更好選擇。但無論是有機溶劑體系還是無溶劑體系，反應時間通常在24 h以上，為了縮短反應時間，可以向有機溶劑體系施加超聲作用[28]或采用超(亞)臨界流體反應體系，該流體黏度小、擴散性能好，且能在一定程度上提高酶活力[29]，從而可以加快反應速度，縮短反應時間，如Xi等[22]發(fā)現，超臨界CO2體系中南極磷蝦磷脂經過7 h的酸解反應，就能得到較高DHA結合率。而于剛等[30]采用的亞臨界R134a反應體系中，大豆磷脂僅經過1 h的酸解反應即可獲得EPA和DHA的量分別為12.23%和39.83%的磷脂。

非水反應體系并非嚴格無水，且適量的水對保持酶活力至關重要。Li等[21]在無溶劑體系通過磷脂酶A1催化的酯-酯交換反應，比較了反應溫度、水分添加量、底物質量比對結合率的影響，發(fā)現水的添加量是影響結合率的最顯著因素，只有水分添加量超過0.5%才具有較高的結合率。但反應體系中含水量過高會加劇磷脂的水解[27]，導致最終產物得率降低。Totani等[10]用柱狀假絲酵母脂肪酶在正己烷體系催化大豆磷脂和沙丁魚油(含11.2%EPA和9.8%DHA)的酯交換反應，所得反應產物中EPA和DHA的量分別為14.5%和3.1%；由于反應體系中含有大量的水，EPA/DHA-PL的得率較低，雖然用甘油替代反應體系中的水可將產物得率由17.0%提高到46.8%，但產物中EPA的量也隨之降低至11.2%；若采用丙二醇和水的混合物替代反應體系中的水[25]，可在保證結合率無明顯降低的同時顯著提高產物得率。即使不額外向反應體系中加入水，由于底物和酶制劑本身含有一定量的水分[9,21]，EPA/DHA-PL的酶促制備過程中水解反應也是難以避免的，有研究者甚至認為水解反應可能是酸解反應過程中必不可少的中間步驟[12,23]。Haraldsson等[12]認為，在1,2-二棕櫚酸磷脂酰膽堿和EPA的酸解反應初期，磷脂水解產生大量的sn-2-溶血磷脂(sn-2-LPC)，一部分sn-2-LPC可與EPA/DHA反應生成EPA/DHA-PL，也有一部分sn-2-LPC會因分子內酰基遷移作用使得位于sn-2位上的脂肪酸緩慢轉移到sn-1位上，從而形成sn-1-溶血磷脂(sn-1-LPC)，由于sn-1-LPC的熱力學穩(wěn)定性強于sn-2-LPC，在長時間的反應過程中，sn-1-LPC不斷得到積累，并先后生成不含脂肪酸的甘油磷酰膽堿、sn-1-EPA-溶血磷脂、sn-2-EPA-溶血磷脂和含有2個EPA的磷脂等產物。該過程提示：雖然采取一定措施脫除體系中的水分也是提高產物得率的有效方法，但選擇合適的脫水時機至關重要——在反應初期脫水，雖然可以提高產物得率，但會抑制磷脂水解，明顯降低EPA/DHA與磷脂的結合率[16]，如果在反應24 h后脫水，不僅可以獲得較高的產物得率，也可明顯提高結合率[21]。

1.4 其他影響因素

除了上述因素，一些反應條件如反應溫度、底物(EPA/DHA供體和磷脂)的比例和酶量等也會對酰基替換法的反應結果產生明顯的影響。

酰基替換法制備EPA/DHA-PL的適宜溫度通常為45～60 ℃，在一定的范圍內，提高反應溫度可增強酶活力并降低反應體系黏度，從而有助于結合率的提高。如Li等[20]將反應溫度從40 ℃提高到55 ℃，可將EPA和DHA的結合率從13.4%提高到27.8%。而提高底物中EPA/DHA的比例可增強溶血磷脂的分子內酰基遷移作用并促進溶血磷脂與EPA/DHA的酯化反應，在一定程度上有助于結合率的提高，但同時也會抑制酸解反應過程中磷脂水解的進行，且過高的底物比例不利于產物的分離純化，所以提高底物比例對酰基替換法(尤其是酸解反應)效率影響的結論并不一致[11-12,23]。

另外，酸解反應中EPA/DHA的結合率高低依賴于酶量的大小[12]，充足的酶量可以保證在磷脂水解的同時催化EPA/DHA與溶血磷脂的酯化反應，酶量不足則會使酯化反應受限，從而不利于結合率的提高[11]。

還有一些物質，如含氨基的化合物和二價陽離子可通過提高脂肪酶的活力來提高反應結合率[7,31]。Marsaoui等[24]以固定化米黑根毛霉脂肪酶為催化劑，在正己烷體系中通過酯-酯交換反應制備EPA/DHA-PL，反應24 h和48 h的結合率分別為5.6%和12.1%，但反應體系中加入尿素和Mg2+之后可將結合率分別提高到17.7%和50.0%。

2 酰基結合法

酰基結合法主要是以溶血型磷脂和EPA/DHA為底物，經酯合成反應得到富含EPA/DHA的磷脂，該法最常使用的催化劑為磷脂酶A2(圖2)。

圖2 酰基結合法制備EPA/DHA-PLFig.2 Preparation of EPA/DHA-PL by acyl-conjunction method

An等[32]最早采用該方法嘗試制備富含EPA/DHA的磷脂酰膽堿，首先通過豬胰磷脂酶A2水解磷脂獲得溶血磷脂酰膽堿，之后采用相同的酶制劑在微乳反應體系催化溶血磷脂酰膽堿和EPA/DHA的酯合成反應，最終產物得率約為6%。為了提高產品得率，Lilja-Hallberg等[33-34]嘗試在有機溶劑體系(將溶血磷脂和EPA/DHA混合后加入少量異辛烷)中進行磷脂的合成，通過提高底物中EPA/DHA的比例、降低反應體系中的水分含量并延長反應時間(80 h和9 d)，將產品得率提高到21%以上。之后H?rr?d等[35]用高壓反應器改善底物與固定化酶的接觸條件，將反應時間縮短到20 h的同時將產品得率提高到25%。

通常認為磷脂酶A2只有在水分活度不低于0.2時才具有活力[36]，適當提高反應體系中的水分雖可提高初始反應速度[35]，但也會加劇水解反應，降低產品得率。為了提高磷脂酶A2的催化效率，Hosokawa等[25]向反應體系中加入適量水模擬物——甲酰胺作為酶激活劑，在提高反應速度的同時抑制磷脂的水解，最終將EPA磷脂產品得率提高到60%左右。Awano等[37]借鑒該方法，在溶血磷脂和DHA的反應中加入甲酰胺，進一步地在反應后期脫除甲酰胺和反應產生的水分，可將DHA磷脂的得率提高到87.1%。而Tanaka等[38]于2012年公布了一項制備EPA/DHA-PL的專利，其在以甘油為溶劑的反應體系中加入CaCl2溶液、氨基酸和肽,以激活磷脂酶A2，催化溶血磷脂和DHA的量為51.8%的脂肪酸，在真空條件下反應，獲得DHA的量高達34.2%的磷脂。

除了磷脂酶A2，具有酯合成活力的脂肪酶也可作為該方法的催化劑。Lyberg等[36]比較了5種脂肪酶和2種磷脂酶催化溶血磷脂和EPA/DHA合成EPA/DHA-PL的結果，發(fā)現少根根霉(Rhizopusarrhizus)脂肪酶和Novozym 435都能催化EPA與溶血磷脂的反應，但僅有Novozym 435可催化DHA與溶血磷脂的反應。由于溶血磷脂底物的sn-1位上不含EPA/DHA，在不考慮酰基遷移和水解反應的前提下，即使sn-2位全部與EPA/DHA結合，所得產物中EPA/DHA的量最高也僅能達到50%左右。Hong等[39]以Novozym 435為催化劑，通過甘油磷酰膽堿(GPC)和共軛亞油酸(為72.2%)反應可獲得共軛亞油酸的量最高為71.5%的磷脂產品，這說明以GPC和EPA/DHA為底物制備高純度EPA/DHA-PL具有一定的可行性，在此基礎上，Liu等[40]在無溶劑體系中通過GPC與DHA的酯合成反應得到DHA溶血磷脂產品。

3 酰基脫除法

南極磷蝦、海洋魚卵等材料中富含以磷脂形式存在的EPA和DHA，且EPA和DHA多存在于磷脂甘油骨架的sn-2位上，為了進一步提高其EPA和DHA含量，一方面可以采用酰基替換法，將磷脂sn-1位上的其他脂肪酸替換為EPA和DHA[22]，另一方面則可以采用酰基脫除法，即通過酶促水解(或醇解)選擇性地除去其甘油骨架上連接的其他脂肪酸，從而得到EPA/DHA被相對富集的溶血磷脂(圖3)。

圖3 酰基脫除法制備EPA/DHA-PLFig.3 Preparation of EPA/DHA-PL by acyl-removal method

磷脂酶A1能夠專一性地水解磷脂sn-1位的脂肪酸，可直接用于酰基脫除法制備EPA/DHA-PL(而磷脂酶A2因為可專一性地水解磷脂sn-2位脂肪酸，通常不在該方法的考慮范圍內)。如王琦[41]以Lecitase ultra為催化劑水解鳶烏賊卵磷脂，可將鳶烏賊卵磷脂中DHA的量由40.3%提高到51.1%。

雖然甘油三酯和磷脂在化學結構上具有一定的相似性，但并非能夠水解甘油三酯的脂肪酶都能用于磷脂的水解，且脂肪酶水解磷脂能力的大小還與反應體系有關[42]。Hara等[43]發(fā)現，在反膠束體系中，來源于毛霉或根霉的脂肪酶具有較高的磷脂水解活力；在有機溶劑體系中，來源于柔毛腐質霉(Humicolalanuginosa)、代氏根霉(Rhizopusdelemar)和褶皺假絲酵母的脂肪酶具有較高的磷脂水解活力[44]。由于天然存在的EPA/DHA多位于磷脂甘油骨架的sn-2位上，脂肪酶的篩選也需進一步考慮其催化位點偏好性，如來源于米黑根毛霉的脂肪酶不僅具有較高的磷脂水解活力，且能專一地水解磷脂sn-1位脂肪酸[45]。Ono等[46]以調節(jié)水分活度的固定化米黑根毛霉脂肪酶Lipozyme IM為催化劑，通過在正己烷體系中磷脂的部分水解反應，將魷魚皮磷脂的DHA的量由33.3%提高至近60%，將DHA蛋黃磷脂的DHA的量由10.9%提高至35%以上。由于酰基遷移作用，磷脂sn-1位上的酯鍵被水解斷裂后暴露出羥基，sn-2位上的EPA/DHA在一定條件下可遷移到sn-1位上[47]，隨后被水解成為游離的EPA/DHA，導致產品得率降低。為了提高EPA/DHA-PL的得率，應當選擇難于催化EPA/DHA水解的脂肪酶。球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)中的DHA主要為磷脂型，且DHA主要位于磷脂的sn-2位，Devos等[48]從天野公司和諾維信公司的12種酶制劑中篩選出對DHA具有“歧視”效應的米根霉(Rhizopusoryzae)和爪哇毛霉(Mucorjavanicus)脂肪酶用于球等鞭金藻DHA磷脂的選擇性水解。

除水解反應之外，磷脂的醇解反應(如磷脂與乙醇反應生成溶血磷脂和脂肪酸乙酯)也可用于提高天然海洋磷脂中EPA和DHA的含量[49]。

酰基脫除法在提高天然海洋磷脂中EPA和DHA含量的同時，伴隨著富含EPA/DHA的溶血磷脂(EPA/DHA-LPL)的產生，該成分除了具有比普通磷脂更強的乳化性能之外，還被認為是為大腦補充DHA的更佳載體[50-52]。

4 結論與展望

現有的酶促制備EPA/DHA-PL的方法通常影響因素多、制備速度慢且工藝成本較高，但其獨特的優(yōu)勢在于可通過磷脂、EPA/DHA供體、酶制劑和制備方法的選擇以及反應條件的優(yōu)化來控制產品的磷脂種類和EPA/DHA的含量或比例。

目前，從海洋生物尤其是南極磷蝦中提取的EPA/DHA-PL產品已經實現產業(yè)化，并在EPA/DHA產品市場中占有越來越高的份額。EPA/DHA-PL的酶促制備目前仍鮮見成功的商業(yè)化案例，但隨著EPA/DHA-PL產品需求的不斷增加和工藝成本的不斷降低，酶促制備的EPA/DHA-PL產品將會有越來越良好的市場前景。