利用果渣產黃腐酸菌劑的篩選

冀頤之，趙有璽，彭雪菲，李思宇，杜 軍,2

(1. 北京聯合大學 生物化學工程學院 生物質廢棄物資源化利用北京市重點實驗室，北京 100023；2. 中國生物發酵產業協會，北京 100833)

水果是人類營養物質的重要來源，也是食品工業發展的基礎原料之一。我國是世界最大的水果生產國，總面積和總產量均居世界第一。根據國家統計局公布的數據，至2015年，全國水果總產量達到2.74億 t[1]。但在果業規模化、集約化發展的同時，水果副產物產量也隨之加大，數量高達上億噸[2]。若不加以合理利用，形成農業固體廢棄物，不僅會造成資源浪費，還會引起環境污染。因此，對水果副產物進行綜合利用，使其變廢為寶，消除環境污染，對我國農業產業可持續發展有著重要意義。

黃腐酸(fulvic acid，FA) 是一種溶于水的灰黑色粉末狀物質，是腐植酸的一種，根據來源可分為礦源腐植酸和生化黃腐酸[3]。生化黃腐酸(biochemical fulvic acid，BFA)是以有機廢棄物為原料，經多種微生物多級發酵轉化而成，具有分子量小、功能團含量多和水溶性好等特點[4]，易被生物吸收利用，在改良土壤[5]、促進植物生長[6]、飼料添加[7]、環境治理[8-10]等領域具有重要發展潛力。

水果副產物包括落果、殘次果和加工后剩余的果皮、果渣、果核、種子、葉、莖、根等下腳料以及加工廢水等[2]。近些年來，水果副產品的綜合利用引起了眾多研究者的關注[11-13]。其中，以果渣等水果副產物為原料，利用生物發酵技術開展了生化黃腐酸的研究，為果渣的資源化利用提供了有效的途徑。惠有為等[14]釆用二步固體發酵工藝利用蘋果渣固體發酵生產黃腐酸，發酵24 d后，黃腐酸產率為41.2%；趙丹等[15]利用復合菌劑對蘋果渣進行混合發酵生產黃腐酸，黃腐酸含量可達24.3%；孫建國等[16]以蘋果渣為基質，復合微生物發酵20～25 d，黃腐酸產量可達22%。

我國每年有大量的水果副產物，如蘋果[17]、菠蘿[18]、香蕉[19]等，其副產物含有豐富的纖維素，利用這些有機廢棄物生產附加值較高的黃腐酸，可實現水果副產物的資源化利用，產生巨大的社會效益和經濟效益。本研究以蘋果渣為原料，進行黃腐酸發酵菌劑的篩選，以期為農業固體廢棄物的資源化利用提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種分離來源

生物腐植酸樣品，某腐植酸生產企業提供。季也蒙酵母(Meyerozymaguilliermondii)(CICC 31056)，長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)(CICC 41185)，保藏于中國工業微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養基

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

高氏一號培養基：可溶性淀粉20.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KNO30.1 g，NaCl 0.5 g，FeSO40.01 g，瓊脂粉20.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。使用之前，在融化的培養基中按照每1 000 mL培養基中加入3.3 mL的比例加入3%的K2Cr2O7溶液。

馬丁氏培養基：葡萄糖10.0 g，蛋白胨5.0 g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，孟加拉紅33.4 mg，蒸餾水1 000 mL，pH自然。使用之前，在融化的培養基中按照1 000 mL培養基中加入0.3 mL的比例加入1%的青霉素溶液。

LB培養基：蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水1 000 mL。

YPD培養基：蛋白胨20.0 g，葡萄糖20.0 g，酵母提取物10.0 g，蒸餾水1 000 mL。

PDA培養基：稱取200 g馬鈴薯切成小塊，加水煮沸20～30 min，8層紗布過濾，加熱，加瓊脂20 g，待瓊脂溶解完后，加入葡萄糖20 g，溶解，補足蒸餾水至1 000 mL。

果渣固態培養基：蘋果果渣干粉20 g，(NH4)2SO40.5 g，麩皮1.5 g，配料時加水混勻，含水分20%，裝入500 mL三角瓶中，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

LRH-150型生化培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；GI54T型高溫高壓滅菌鍋，致維儀器有限公司；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺，蘇州凈化有限公司；GelDoc2000型凝膠成像系統，美國伯樂公司；ABI9700型PCR擴增儀，美國應用生物系統公司。

1.3 方法

1.3.1 腐植酸樣品中微生物的分離純化

稱取10 g生物腐植酸樣品，放入盛有100 mL無菌水并帶有玻璃珠的錐形瓶中，振搖10 min后，吸取菌液進行梯度稀釋，并取適宜稀釋度的液體分別涂布于牛肉膏蛋白胨培養基、高氏一號培養基、馬丁氏培養基固體平板上，倒置于45 ℃生化箱中培養。挑取平板上生長良好，且形態特征不同的單菌落，進一步純化后，轉接于斜面培養，并置于冰箱4 ℃條件下保存。

1.3.2 黃腐酸生產菌株的篩選

將初篩菌株接入LB培養基中培養24 h，以10%的接種量接入果渣固態培養基中，45 ℃生化培養箱培養20 d。發酵過程每天補充無菌水5 mL，以補充蒸發的水分。

1.3.3 黃腐酸復合菌劑的篩選

復合菌劑1由BFA02和BFA03以體積比1∶ 1構成；復合菌劑2由季也蒙酵母、BFA02和BFA03以體積比1∶ 1∶ 1構成；復合菌劑3由長枝木霉、BFA02和BFA03以體積比1∶ 1∶ 1構成；復合菌劑4由季也蒙酵母、長枝木霉、BFA02和BFA03以體積比1∶ 1∶ 1∶ 1構成。其中，BFA02、BFA03接種至LB培養基中，37 ℃、200 r/min過夜培養；季也蒙酵母接種至YPD培養基中，28 ℃、200 r/min培養24 h；長枝木霉接種至PDA固體斜面，28 ℃生化箱中培養4 d，加入無菌水，刮孢子，經適當稀釋配制成密度為107左右的孢子懸液。各復合菌劑按上述比列混合，按10%的接種量接入果渣固態培養基中，45 ℃生化培養箱培養20 d。發酵過程每天補充無菌水5 mL，以補充蒸發的水分。

1.3.4 黃腐酸生產菌株的分類鑒定

1.3.4.1 形態學特征

將純化后的菌株接種于LB固體平板培養基上，37 ℃培養24 h 后觀察其菌落生長情況和形態。挑取單個菌落制成玻片，革蘭氏染色[20]，置于光學顯微鏡下，16×100，觀察各菌株的顯微形態。

1.3.4.2 分子生物學鑒定

采用細菌菌株的通用引物：正向引物27F 5’-A￣G￣A￣G￣T￣T￣G￣A￣T￣C￣C￣T￣G￣G￣C￣T￣C￣A￣G -3’；反向引物1492R:5’-G￣G￣T￣T￣A￣C￣C￣T￣T￣G￣T￣T￣A￣C￣G￣A￣C￣T￣T-3’；進行菌落PCR，擴增16S rDNA。

PCR反應體系： 10×Buffer(含Mg2+)2 μL，dNTP(各2.5 mmol/L)2 μL，F(10 μmol/L)2 μL，R(10 μmol/L)2 μL，rTaq DNA 聚合酶0.5 μL，加雙蒸水至20 μL。

PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，25 個循環；72 ℃修復延伸7 min；最后4 ℃終止反應。

擴增產物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳回收，純化后的產物測序后獲得的16S rDNA 序列，登錄http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 網站，用Blast 程序進行序列比對分析，選取與之相似性高的菌16S rDNA 序列，使用 MEGA 5.0 軟件比對、分析、構建系統發育樹，Bootstrap 1 000 次進行穩定性驗證。

1.3.5 纖維素、半纖維素及木質素的測定

參考侯勇[21]的方法，進行纖維素、半纖維素及木質素的測定。降解率計算見式(1)～(3)。

(1)

式中：mC1為發酵前纖維素含量，g；mC2為發酵后剩余纖維素含量，g。

(2)

式中：mH1為發酵前半纖維素含量，g；mH2為發酵后剩余半纖維素含量，g。

(3)

式中：mL1為發酵前木質素含量，g；mL2為發酵后剩余木質素含量，g。

1.3.6 黃腐酸的測定

采用滴定法進行黃腐酸測定[22]。黃腐酸產量計算見式(4)。

黃腐酸產量=B2-B1

(4)

式中：B1為發酵前體系中黃腐酸含量，g/kg；B2為發酵后體系中黃腐酸含量，g/kg。

2 結果與討論

2.1 黃腐酸生產菌株的篩選

2.1.1 黃腐酸樣品微生物的分離純化

按照方法1.3.1對生物腐植酸樣品進行分離純化。由于天然腐植酸生產通常是在高溫下進行，因此確定篩選溫度為45 ℃。通過平板稀釋法涂布，45 ℃培養4 d，僅從牛肉膏蛋白胨培養基中篩選出生長良好、形態不同的4株菌株，分別編號為BFA01、BFA02、BFA03、BFA04作為本研究初篩菌株，用于后續實驗。

2.1.2 黃腐酸生產菌株的復篩

將初篩獲得的4株菌接種于果渣固態培養基中，45 ℃發酵20 d，分別測定其黃腐酸產量和木質纖維素降解率，結果如圖1所示。從圖1可知，菌株BFA02、BFA03兩株菌黃腐酸產量較高，分別為43.67、59.35 g/kg，具有較好的黃腐酸生產性能。

圖1 初篩菌株的黃腐酸產量Fig.1 Fulvic acid production of the isolated strains

考察4株菌株的木質纖維素降解能力，結果如圖2所示。從圖2可以看出菌株BFA02纖維素和木質素降解能力較好，其纖維素和木質素降解率分別為34.42%、29.7%。而BFA03則具有非常好的半纖維素降解能力，其降解率為32.81%。自然界中木質纖維素的分解多依賴于纖維素、半纖維素和木質素分解菌株的協同作用，多菌混合發酵，可提高纖維素的轉化效率[23-25]，因此選定菌株BFA02、BFA03為黃腐酸生產菌株，進行復配實驗。

圖2 初篩菌株的木質纖維素降解率Fig.2 Degradation rate of cellulose,hemi cellulose and lignin by the isolated strains

2.1.3 菌株BFA02、BFA03的鑒定及進化樹構建

2.1.3.1 菌落形態特征觀察

在45 ℃培養24 h 后對菌株BFA02、BFA03進行菌落形態及顯微特征的觀察，結果如圖3所示。由圖3可見：菌株BFA02菌落形態為扁平，邊緣不整齊，擴展，表面粗糙，中間有環狀隆起皺褶，乳白色、不透明。顯微鏡下觀察菌株BFA02，其為革蘭氏陽性菌，菌體均一，呈短桿狀。菌株BFA03菌落呈圓形，邊緣鋸齒狀，菌落輕微隆起，表面黏稠，白色，不透明。顯微鏡下觀察菌株BFA03，其菌體均一，呈桿狀，革蘭氏陽性菌。

圖3 菌株BFA02和BFA03的菌落形態觀察Fig.3 Colonial characteristics of strain BFA02 and BFA03

2.1.3.2 分子生物學鑒定

分析了菌株BFA02和BFA03的16S rDNA，結果如圖4所示。由圖4可知：其片段長度均為1 456 bp，經基因序列比對分析，發現BFA02與BacillusamyloliquefaciensHYM25相似度最高為99%，BFA03與B.licheniformisCGMCC2876相似度最高為99%。基于它們的16S rDNA所構建的系統發育進化樹(圖5、6)，初步確認BFA02為解淀粉芽孢桿菌，BFA03為地衣芽孢桿菌。

1—菌株BFA02的PCR擴增產物；2—菌株BFA03的PCR擴增產物；M—標準DNA圖4 菌株BFA02和BFA03的16S rDNA PCR擴增結果Fig.4 Electrophoresis of PCR amplification products of bacterial 16S rDNA from BFA02 and BFA03

圖5 菌株BFA02 16S rDNA 系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain BFA02 based on 16S rDNA sequence

圖6 菌株BFA03 16S rDNA 系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree of strain BFA03 based on 16S rDNA sequence

2.2 復配菌劑的篩選

研究表明，固體廢棄物在堆肥過程中，相比自然發酵，采用人工接菌的方式更有利于脂肪、蛋白質、多糖等成分的生物降解，促進腐植酸和黃腐酸的生成[26-28]；如果同時接入木質纖維素降解菌株，如木霉、白腐真菌等，將會更有效地加速堆肥過程[27-29]。因此，考慮將篩選獲得的黃腐酸生產菌株BFA02、BFA03與長枝木霉、季也蒙酵母進行復配，以獲得最佳的復合菌劑。

按1.3.3節的方法制備4組復合菌劑，分別以10%的接種量接入果渣固態培養基中，進行黃腐酸發酵實驗，20 d后測定其生化黃腐酸含量及木質纖維素降解率，實驗結果見圖7～8。由圖7～8可知，復合菌劑發酵優于單菌發酵，其黃腐酸產量均高于單菌發酵產量。其中，由BFA02、BFA03和長枝木霉構成的復合菌劑3實驗組黃腐酸產量最高，可達103.19 g/kg。該實驗組纖維素、半纖維素、木質素降解率分別為46.25%、39.49%、37.5%，均高于其他單菌或復合菌劑實驗組。文獻[30]報道，長枝木霉具有很好的木質纖維素降解能力，可利用自身的酶系，高效分解底物，提高底物轉化率。因此，加入長枝木霉后，促進了底物轉化，提高了黃腐酸產量。實驗中還發現，當BFA02、BFA03、季也蒙酵母、長枝木霉4株菌株復配后，其各項性能低于復合菌劑3。分析原因，可能是由于復配菌劑各菌株之間的拮抗作用引起的。有研究報道木霉對其他真菌具有多種拮抗作用，諸如產生抗生物質、營養爭奪及產生幾丁質酶等[22]。另一原因，也可能是由于BFA02、BFA03、季也蒙酵母及長枝木霉4種菌株各按2.5%的接種量接入，單菌起始菌量較低，延滯期長，最終導致黃腐酸產量較低。

圖7 復合菌劑和單菌發酵的黃腐酸產量Fig.7 Fulvic acid production of the mixed cultures and single strain

圖8 復合菌劑和單菌發酵的木質纖維素降解率Fig.8 Degradation rates of cellulose,hemi-cellulose and lignin by the mixed cultures and single strain

3 結論

從腐植酸樣品中經分離篩選獲得2株具有較好木質纖維素降解能力的黃腐酸生產菌株BFA02和BFA03，其中BFA02菌株是具有良好纖維素和木質素降解能力，BFA03具有良好的半纖維素降解能力。經16SrDNA分類鑒定，初步確認BFA02為解淀粉芽孢桿菌，BFA03為地衣芽孢桿菌。季也蒙酵母、長枝木霉分別與BFA02和BFA03復配后發酵，實驗結果表明，長枝木霉、BFA02和BFA03復配構成的復合菌劑3具有較好的木質纖維素降解能力，黃腐酸產量最高可達103.19 g/kg，較BFA02、BFA03單菌發酵分別提高了136%和74%。長枝木霉具有優良的木質纖維素降解能力，與BFA02和BFA03復配，可高效分解底物，提高黃腐酸產量。

因此，篩選優良的復合菌劑對于提高黃腐酸產量意義重大。在我國每年都有數以億噸的果渣以及其他農產品加工廢棄物，這些廢棄物量大而且相對集中，資源化利用固體廢棄物發酵制取黃腐酸，不僅可以解決環境污染問題，還可促進農業可持續發展，具有很高的經濟效益和社會效益。