LC-MS/MS法同時測定大鼠血漿中地榆皂苷Ⅰ和地榆皂苷Ⅱ的血藥濃度及其藥代動力學

唐 俊，張 杰，孫 偉，趙 昂，朱志銘，鮑曉文，張銘雅，馬 博

(1.江蘇黃河藥業股份有限公司,江蘇 阜寧 224400；2.南京工業大學 藥學院，江蘇 南京 211800；3.江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，江蘇 南京 210008)

地榆(SanguisorbaofficinalisL.)為薔薇科地榆屬植物地榆的干燥根，性微寒、味苦，歸肝、大腸經，具有涼血止血、解毒斂瘡的作用[1]。從地榆中分離得到的地榆皂苷Ⅰ(ZiyuglycosideⅠ)和地榆皂苷Ⅱ(ZiyuglycosideⅡ)為地榆中具有藥理活性的主要成分[2]。現代藥理學研究表明，地榆中的皂苷類成分具有抗腫瘤和美容護膚的作用[3-4]，其中，地榆皂苷Ⅰ既可以防止膠原纖維的降解，又能有效促進I型膠原蛋白的生成，減少皮膚皺紋，有望被開發成為新一代的美容護膚品；地榆皂苷Ⅱ能夠抑制血管生成，起到抗腫瘤轉移的作用[5]。因此，地榆中皂苷類成分的含量測定對其進一步的藥學研究發開具有重要意義。現有研究中主要采用高效液相色譜-紫外檢測法(HPLC-UV)[6]、高效液相色譜-蒸發光散射檢測器法(HPLC-ELSD)[7]、液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)[8]、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[9]、液相色譜-四極桿/飛行時間質譜法(LC-Q-TOF/MS)[10]等方法對地榆植物中的活性成分進行了含量的測定。但地榆總皂苷因其較差的水溶性，在動物實驗中的給藥方式大多為口服給藥。因此，鮮有對其在體內的絕對生物利用度的相關研究。

本文中，筆者擬建立快速、靈敏、簡便的LC-MS/MS法測定大鼠血漿中地榆皂苷Ⅰ和地榆皂苷Ⅱ的方法并運用于大鼠體內藥物代謝動力學研究，以期為地榆皂苷系列化合物的藥物開發提供數據支持。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ、竹節香附素A(經HPLC檢測，純度≥98%)，上海源葉生物科技有限公司；甲酸(質譜純)，Sigma公司；甲醇(色譜純)，Merck公司；超純水，Millipore公司。

SD大鼠12只(動物合格證號:SCXK (蘇) 2016—0004)，揚州大學比較醫學中心，體質量(200±10) g，雌雄各半。飼養環境：室溫(22±2)℃，相對濕度(50±10)%，12 h/12 h晝夜循環。

1.2 主要儀器

AB Sciex 4000型三重四級桿串聯質譜儀，Sciex公司；UFLC-20A型高效液相色譜儀，Shimadzu公司；BT125D型電子天平，Sartorius公司；SPD2010型真空濃縮裝置、5810R型冷凍離心機，Thermo Fisher公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 高效液相色譜條件

色譜柱為Ultimate XB-C8色譜柱(100 mm×2.1 mm,3 μm,Welch)，柱溫為40 ℃，流動相為乙腈(含0.05%甲酸)-水(2 mmol/L乙酸銨)(體積比為52∶ 48)，采用等度洗脫，流速0.20 mL/min，進樣量5 μL，每個樣品檢測所需時間為6 min。

1.3.2 質譜檢測條件

電噴霧離子源(ESI)，多級反應監測(MRM)，負離子模式，輔助氣溫度(turbo gas temperature)為450 ℃，輔助氣(GS1)為275.79 kPa(40 psi)，霧化氣(GS2)為379.21 kPa(55 psi)，氣簾氣(CUR)為68.94 kPa(10 psi)，離子噴霧電壓(IS)為-4 500 V。

在此條件下相關離子如表1所示。

1.3.3 溶液的配制

分別精密稱取地榆皂苷Ⅰ，地榆皂苷Ⅱ，竹節香附素A各10.00 mg，加入甲醇定容至10 mL，配制成質量濃度為1 mg/mL的儲備液，于-20 ℃下保存；分別取地榆皂苷Ⅰ，地榆皂苷Ⅱ儲備液，用甲醇梯度稀釋，分別配制成10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000和20 000 ng/mL的工作液；取竹節香附素A儲備液，用甲醇稀釋至質量濃度為1 μg/mL的內標工作液。分別配制濃度為16、1 600 和16 000 ng/mL的地榆皂苷Ⅰ和地榆皂苷Ⅱ的質控工作液。

表1 各物質MRM模式檢測離子

1.3.4 血漿樣品的處理方法

取100 μL 血漿，加入10 μL(1 μg/mL)內標工作液，混勻振蕩30 s，隨后加入0.4 mL 甲醇溶液，渦旋振蕩5 min，于12 000 g、4 ℃下離心10 min，取上清液0.4 mL，用Speed Vac真空濃縮裝置揮干，殘渣用100 μL 流動相溶解，于20 000g、4 ℃下離心10 min，取上清液5 μL 進樣分析。

1.3.5 藥代動力學試驗

SD大鼠12只實驗前禁食12h后隨機均分為2組：口服給藥組和靜脈注射組，每只大鼠給藥2 mg/kg地榆皂苷Ⅰ和地榆皂苷Ⅱ的混合物。采血點設計如下，口服給藥組：口服給藥前及服藥后0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8和12 h 時眼眶后靜脈叢采血200 μL，置于肝素鈉化的試管中；靜脈注射組：靜脈注射前及注射后0.033、0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8和12 h時眼眶采血200 μL，置于肝素鈉化的試管中。全血樣品于3 000g離心10 min獲取血漿。血漿樣品立即放置-70 ℃冰箱中凍存待測。采用DAS3.0 軟件中的非房室模型法計算藥動學參數。

2 結果與討論

2.1 分析方法的專屬性

圖1顯示了6 份不同來源的空白大鼠的血漿，按1.2.4節的方法處理后其中地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ及內標的保留時間分別為1.91、3.08和2.82 min。

由圖1可知：血漿中內源性物質不干擾待測物質的測定；待測物及內標的峰型較好。表明該方法具有較高的專屬性。

圖1 大鼠血漿樣品及加入一定濃度地榆標準品溶液(a)和大鼠靜脈注射地榆標準品5 min后(b)血漿的色譜圖Fig.1 Typical MRM chromatograms of blank plasma sample added with standard solution of ZiyuglycosideⅠand ZiyuglycosideⅡ (a) and rat plasma sample obtained at 5 min after tail vein injection (b)

2.2 線性關系的考察

取空白血漿90 μL，分別加入地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ工作液，配制成含地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ為1～2 000 ng/mL的含藥血漿，按1.2.4節的方法處理。以血漿中待測物的濃度為橫坐標、待測物的峰面積與內標的峰面積之比為縱坐標，用加權最小二乘法(W=1/ρ2) 進行回歸運算，得線性方程分別為：Y=0.009 67X+0.010 8，相關系數R=0.999 1(地榆皂苷Ⅰ)；Y=0.002 52X+0.000 151，相關系數R=0.995 2(地榆皂苷Ⅱ)。數據表明地榆皂苷Ⅰ，地榆皂苷Ⅱ在1～2 000 ng/mL范圍內與峰面積比值的線性關系良好，定量下限均為1 ng/mL(信噪比S/N>10)。

2.3 精密度與準確度試驗

分別配制含地榆皂苷Ⅰ和地榆皂苷Ⅱ的定量下限(LLOQ)，低、中、高濃度(1、1.6、160和1 600 ng/mL)4個濃度的血漿樣本各6份，按1.2.4節的方法處理，根據當日的標準曲線計算質控樣品的測得濃度。將質控樣品的分析結果進行方差分析，計算方法的精密度與準確度結果見表2。由表2可知，樣品批間和批內分析精密度均小于15%，實驗結果符合生物樣品的測定要求。

表2 LC-MS/MS 法測定地榆皂苷Ⅰ及Ⅱ的精密度與準確度

2.4 提取回收率與基質效應

按1.2.4節的方法處理低、中、高濃度的質控樣品，每個濃度6個樣本，以其進樣得到的峰面積除以空白血漿經處理后再加入低、中、高濃度的質控溶液及內標溶液后進樣得到的峰面積，計算血漿中地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ的提取回收率與基質效應，結果見表3。由表3可知，在實驗中未見到明顯的基質效應，兩種物質的提取回收率良好。

表3 LC-MS/MS 法測定地榆皂苷Ⅰ及Ⅱ的基質效應及提取回收率

2.5 穩定性的考察

配制含地榆皂苷Ⅰ和地榆皂苷Ⅱ的低、中、高濃度對照品血漿各6份，分別于-70 ℃反復凍融3 次、室溫放置12 h、4 ℃自動進樣器中放置24 h和-70 ℃冷凍保存1個月。按1.2.4節的方法處理樣品，測定血漿中地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ的濃度，分別考察凍融循環、室溫、4 ℃自動進樣盤和長期冷凍保存條件下的穩定性，結果見表4。由表4可知，地榆皂苷Ⅰ和地榆皂苷Ⅱ在各條件下穩定性良好。

表4各儲存條件或處理條件下地榆皂苷Ⅰ及地榆皂苷Ⅱ的穩定性

Table 4Stability of ZiyuglycosideⅠand ZiyuglycosideⅡ under various conditions (n=6)

化合物理論質量濃度/(ng·mL-1)相對標準偏差RSD/%凍融循環3次室溫放置12 h4 ℃放置24 h長期凍存21 d地榆皂苷Ⅰ1.6-9.6-6.5-3.8-10.2160.0-10.3-4.48.7-7.41 600.0-12.53.84.23.7地榆皂苷Ⅱ1.6-7.42.9-8.2-6.5160.0-9.65.4-7.63.81 600.0-8.77.25.7-7.1

2.6 藥代動力學研究結果

采用建立并經過考證的LC-MS /MS方法檢測大鼠血漿中地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ的濃度，繪制血藥濃度-時間曲線見圖2和圖3，采用DAS3.0軟件應用非房室模型法計算藥動學參數見表5。由圖2可知，地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ經靜脈注射進入大鼠體循環后，血液中藥物濃度即達到最高，并且藥物濃度隨著時間逐漸降低。由圖3可知，大鼠口服地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ后，血液中藥物濃度逐漸上升。血藥濃度分別在(0.500±0.204)h和(0.438±0.125)h時刻達到最高(69.506±25.857)ng/mL和(55.350±10.313)ng/mL。由表5可知，大鼠口服和靜脈注射地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ的絕對生物利用度(Fabs)分別為(9.580±3.886)%、(12.215±3.353)%。兩種物質的口服絕對生物利用度較低，可能與其水溶性較差有關。

圖2 大鼠靜脈注射地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ后血藥濃度-時間曲線Fig.2 Plasma concentration-time profiles of ZiyuglycosideⅠand ZiyuglycosideⅡ after tail vein injection

圖3 大鼠口服地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ后血藥濃度-時間曲線Fig.3 Plasma concentration-time profiles of ZiyuglycosideⅠand ZiyuglycosideⅡ after oral administration

表5 大鼠分別靜注注射和口服地榆皂苷Ⅰ和地榆皂苷Ⅱ藥代動力學參數

注：AUC 為血藥濃度時間曲線下面積；ρmax為血藥濃度峰值；tmax是指用藥以后，血藥濃度達到峰值所需的時間；MRT為平均駐留時間；V為表觀分布容積；CL為清除率；t1/2為半衰期；Fabs為絕對生物利用度。

3 結論

本文中，筆者建立了LC/MS-MS方法用于同時測定大鼠血漿中地榆皂苷Ⅰ和地榆皂苷Ⅱ。此法具有專屬性好、靈敏度高、線性良好、精密度良好且準確度高的特點。在此方法學研究的基礎上，進行了地榆皂苷Ⅰ和地榆皂苷Ⅱ在大鼠體內的藥物代謝動力學研究。結果顯示，地榆皂苷Ⅰ和地榆皂苷Ⅱ口服吸收較快，但吸收不完全。兩種化合物生物利用度均較低，可能是由于化合物的脂溶性較差。實驗結果為進一步研究和開發地榆皂苷Ⅰ和地榆皂苷Ⅱ類生物制品提供了理論基礎。