常見電子介體對大腸桿菌微生物燃料電池產電性能的影響

劉海霞，李雪明，宋天順,2，謝婧婧,2,3

(1.南京工業大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京 211800；2.南京工業大學 材料化學國家重點實驗室，江蘇 南京 210009；3.江蘇省先進生物制造協同創新中心，江蘇 南京 210009)

隨著能源危機的日益加重，開發綠色能源已經成為目前迫切的研究方向之一[1-3]。微生物燃料電池(microbial fuel cell，MFC)是一種應用前景廣泛的綠色能源系統[4-7]，它利用產電微生物的新陳代謝，降解有機底物，產生胞外電子和質子，電子通過陽極傳遞至陰極，質子通過質子交換膜由陽極室轉移至陰極室，從而實現將儲存在有機底物中的化學能轉化為電能[4-7]。MFC是以微生物菌株作為催化劑，通過微生物代謝將存儲于生物質中的化學能轉化為電能的一種環保裝置[8-12]。

在MFC中,電化學活性微生物由于其細胞膜上具有電活性的氧化還原酶，可以與電極直接發生電子傳遞，但大多數的微生物菌株不能和電極直接發生電子轉換，為提高非電化學活性微生物氧化底物傳遞電子的效率，需要借助適量電子介體的幫助[13-17]，以顯著改善電子的轉移速率。用于這類MFC的有效電子介體應具備以下特性[18-21]：①良好的穩定性、溶解性且不能被細菌代謝。②易穿過細胞壁，易獲取電子。③電極上氧化還原反應速率快，可逆性好。

本文中，筆者以3種電子介體(中性紅、亞甲基藍和甲基紫精)為對象，研究它們對大腸桿菌BL21(DE3)生長抑制情況及對其MFC產電性能的影響，以期為后續的研究提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

大腸桿菌BL21(DE3)為南京工業大學謝婧婧教授課題組長期保存菌株。

蛋白胨、酵母粉、鐵氰化鉀、葡萄糖、NaCl等實驗試劑均為市售分析純。

M9培養基(g/L)：葡萄糖4、NH4Cl 1、NaCl 0.5、Na2HPO44.756、NaH2PO42.452。

LB培養基(g/L)：蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10；自然pH。

陰極液組(g/L)：KCl 0.13、Na2HPO411.53、NaH2PO42.772、K3Fe(CN)613.2。

GRP-905型隔水式電熱恒溫培養箱，上海森杰實驗儀器有限公司；數據采集器，美國吉時利電子有限公司；電化學工作站，上海辰華儀器有限公司；H型 MFC反應器，廣西理化有限公司。

1.2 MFC反應器構建

采用雙室微生物燃料電池反應器，結構如圖1所示，陽離子交換膜(Nafion 117,美國杜邦公司)將陰、陽兩室隔開，兩室溶液體積均為250 mL。陰陽極電極材料均為石墨氈，陰、陽電極物理表面積均為25 cm2×2，陰陽極之間通過鈦絲相連，除實驗因素外，外接電阻均為1 000 Ω。MFC 均置于25 ℃恒溫生化培養箱中運行。陽極液由95% M9培養基和5% LB培養基構成。

圖1 微生物燃料電池原理工作圖Fig.1 Mechanism for microbial fuel cell

1.3 實驗方法

1.3.1 常見電子介體對大腸桿菌BL21(DE3)的生長抑制實驗

常見電子介體對菌的生長抑制情況是通過菌液涂布計數比較得出，具體步驟為：①菌種的液體活化。準備滅菌后的液體LB，以10%的接種量活化從冰箱中保存的大腸桿菌BL21(DE3)菌株，在恒溫搖床(200 r/min)中37 ℃培養12 h，待用。②制備含有不同濃度電子介體的LB平板。配制含有不同質量濃度的中性紅和亞甲基藍(0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 g/L)的LB平板。由于甲基紫精，也叫百草枯，生物毒性大，因此平板制備濃度要低于中性紅和亞甲基藍。配制含有不同質量濃度(0、0.01、0.02、0.03、0.04和0.05 g/L)甲基紫精的LB平板。③菌液涂布計數。將活化后的菌液等量稀釋涂布于LB平板上，涂布結束后將平板放置在37 ℃恒溫培養箱中培養12 h，然后對平板上長出的大腸桿菌BL21(DE3)菌落進行計數，確定其生長抑制情況。

1.3.2 常見電子介體對大腸桿菌BL21(DE3)MFC產電性能影響

依據電子介體對大腸桿菌BL21(DE3)的生長抑制結果，選擇合適的實驗濃度，開展同一濃度下不同電子介體對大腸桿菌BL21(DE3)MFC產電性能的影響實驗，選擇對MFC產電能力提高顯著的電子介體后再進行濃度優化實驗。

1.4 MFC性能參數測定及計算

1.4.1 電壓和電流

電壓(U)由山特(深圳)電子有限公司數據采集器每間隔10 min 自動記錄儲存。電流由I=U/R(R為實際外接電阻)計算得到[21-23]。

1.4.2 電池表觀內阻及功率密度曲線

采用穩態放電法測定MFC的表觀內阻。分別測量MFC在不同外電阻(5 000、4 000、3 000、2 000、1 000、800、600、400、200、100、50和30 Ω)條件下穩定放電時的外電阻電壓，并通過I=U/R得到電流，輸出功率(P)是根據P=IU得出[24]。以電流為橫坐標，電壓為縱坐標，繪制所得曲線為極化曲線。極化曲線是用來表征電壓與電流關系的曲線，將極化曲線的歐姆極化區部分數據線性擬合所得斜率即為電池表觀內阻。再以電流為橫坐標，各外阻條件下產生的功率密度為縱坐標繪制曲線，即得電池功率密度曲線，功率密度曲線是用來表示電流和功率密度關系的曲線[17,22-24]。

1.4.3 循環伏安曲線測定

循環伏安法(CV)使用CHI660D型三電極系統恒電位儀(上海辰華儀器有限公司)進行測定。其中，陽極對應工作電極，陰極對應對電極，Ag/AgCl電極對應參比電極。掃描電壓為-1.0～1.0 V，掃描速度為20 mV/s，同時監測電流響應值[17,25-27]。

2 結果與討論

2.1 常見電子介體對大腸桿菌BL21(DE3)生長抑制情況

人工電子介體雖然能夠幫助大腸桿菌BL21(DE3)將電子傳遞到電極上，但也會對其生長有一定的抑制作用。因此，在進行產電性能影響實驗之前，有必要確定所選擇電子介體對大腸桿菌BL21(DE3)的生長抑制濃度范圍。

考察大腸桿菌BL21(DE3)在含有不同質量濃度的中性紅、亞甲基藍以及甲基紫精的LB平板上的生長情況，結果見圖2。

圖2 電子介體對大腸桿菌BL21(DE3)生長的影響Fig.2 Effects of electron mediator on the growth of E. coli BL21(DE3)

由圖2可知：大腸桿菌BL21(DE3)含有不同濃度的中性紅平板上的菌落數分別為100、94、85、79、68和65個。盡管中性紅為無毒染料，但是生長抑制實驗證明，隨著濃度的增加，中性紅對大腸桿菌BL21(DE3)生長的抑制也隨之增加。可能的原因是中性紅延長了菌落生長的時間，因此在24 h內計數出現上述結果，當延長計數時間后，發現高濃度平板上繼續會有新的菌落出現。

大腸桿菌BL21(DE3)在不同濃度的亞甲基藍的LB平板上的生長的菌落數分別為100、30、1、1、1和1 個。當亞甲基藍的質量濃度大于0.4 g/L時，在24 h內大腸桿菌BL21(DE3)在平板上幾乎沒有菌落生成，觀察生成的菌落形態，發現其菌落大小明顯小于低濃度平板上的菌落。說明添加高質量濃度(>0.4 g/L)亞甲基藍的對大腸桿菌BL21(DE3)生長抑制顯著。

大腸桿菌BL21(DE3)在含有不同濃度甲基紫精的LB平板上的生長的菌落數分別為100、55、43、1、1和1個。在質量濃度超過0.03 g/L及以上濃度的甲基紫精LB平板上都只有1個菌落生長，同亞甲基藍類似，這說明甲基紫精對于大腸桿菌BL21(DE3)生長抑制較明顯。

電子介體對于大腸桿菌BL21(DE3)的生長抑制從高到低依次是甲基紫精、亞甲基藍、中性紅。

2.2 常見電子介體對大腸桿菌BL21(DE3)MFC產電性能影響結果

2.2.1 大腸桿菌BL21(DE3)MFC產電性能比較

考慮到未來實驗放大要求，所以實驗應當篩選合適的電子介體，還必須滿足添加量少且提高效果顯著的要求，結合菌株生長抑制實驗，實驗最終確定研究質量濃度為0.02 g/L的中性紅、亞甲基藍、甲基紫精對大腸桿菌BL21(DE3)MFC產電性能的影響，結果如圖3～5和表1所示。

圖3 不同電子介體實驗組MFC輸出電壓Fig.3 Voltage output of the MFC with different electron mediator

由圖3可知：添加亞甲基藍對大腸桿菌BL21(DE3)產電性能的提高是最顯著的，MFC能夠達到的最高穩定電壓值為389 mV；添加中性紅的實驗組，MFC能夠達到的最高電壓值為130 mV，并且電壓峰值(130 mV)只維持了6 h左右；添加甲基紫精的實驗組，MFC能夠達到的最高穩定電壓值只有70 mV，而對照組MFC能夠達到的最高穩定電壓值為80 mV。亞甲基藍的輸出電壓較對照組的提高了386%，添加甲基紫精的實驗組輸出電壓與對照組相比沒有提高，中性紅組的輸出電壓提高不顯著。

表1 添加常見電子介體各實驗組MFC的最大輸出功率密度及表觀內阻

圖4 常見電子介體MFC的功率密度及極化曲線Fig.4 Power density (a) and polarization curve (b) of the MFC

圖5 常見電子介體MFC循環伏安曲線Fig.5 Different electron mediator circulation volt-ampere curve

由圖4和表1可知：添加亞甲基藍的實驗組產電能力最優，其所測得的最大輸出功率密度高達160 mV/m2，而對照組僅為18 mV/m2；甲基紫精組和中性紅組的最大輸出功率分別為3.8和5.2 mV/m2。對各實驗組MFC極化曲線歐姆區進行線性擬合后得到各MFC的表觀內阻，其中亞甲基藍組的表觀內阻最低，約為159 Ω；中性紅組的表觀內阻約為380 Ω；甲基紫精組的表觀內阻約為278 Ω，對照組的表觀內阻為290 Ω。由此可見，添加亞甲基藍的表觀內阻最小，較對照組降低約52%。

由圖5可知：亞甲基藍實驗組測得的氧化還原電流響應值最高，且明顯較對照組MFC信號強，中性紅次之，甲基紫精與對照組無明顯差異。CV分析證明添加亞甲基藍的MFC組能夠提高大腸桿菌BL21(DE3)MFC的產電性能，由此可以確定亞甲基藍作為電子介體可以增強陽極電極的電化學活性，這與輸出電壓、功率密度和極化曲線的結論一致。這可能是由于亞甲基藍具有從細菌細胞膜上高效轉移電子的能力。

圖7 添加不同濃度亞甲基藍的MFC功率密度及極化曲線Fig.7 Power density (a) and polarization curve of MFC (b) with different concentration of methylene blue

2.2.2 亞甲基藍濃度優化

在0.02 g/L中性紅、亞甲基藍和甲基紫精作用下，添加亞甲基藍對大腸桿菌BL21(DE3)的產電能力提高最顯著，因此考察不同質量濃度的亞甲基藍對提高大腸桿菌BL21(DE3)MFC產電性能的影響，結果如圖6～8和表2所示。

圖6 添加不同濃度亞甲基藍的各實驗組MFC輸出電壓Fig.6 Voltage output of the MFC with different concentration of methylene blue

由圖6可知：添加0.02 g/L亞甲基藍實驗組MFC能夠達到的最高穩定電壓值為389 mV;添加0.04 g/L亞甲基藍實驗組MFC能夠達到的最高穩定電壓值為380 mV;添加0.06 g/L亞甲基藍實驗組MFC能夠達到的最高穩定電壓值為500 mV;添加0.08 g/L亞甲基藍實驗組MFC能夠達到的最高穩定電壓值為375 mV;添加0.10 g/L亞甲基藍實驗組MFC能夠達到的最高穩定電壓值為300 mV，對照組MFC能夠達到的最高穩定電壓值為80 mV，分別較對照提高了386%、375%、525%、371%和275%。

由圖7和表2可知：添加0.02 g/L亞甲基藍實驗組MFC所獲得的最大輸出功率密度為160 mV/m2；添加0.04 g/L亞甲基藍實驗組MFC所獲得的最大輸出功率密度為184 mV/m2；而0.06 g/L亞甲基藍實驗組的產電能力最優，其所獲得的最大輸出功率密度高達208 mV/m2；添加0.08 g/L亞甲基藍實驗組MFC所獲得的最大輸出功率密度為178 mV/m2；添加0.10 g/L亞甲基藍實驗組MFC所獲得的最大輸出功率密度為156 mV/m2，對照組MFC的最大輸出功率密度為18 mV/m2。

對各實驗組MFC極化曲線歐姆區進行線性擬合得到的各MFC表觀內阻結果發現：添加0.02 g/L亞甲基藍實驗組MFC表觀內阻為159 Ω，添加0.04 g/L亞甲基藍實驗組MFC表觀內阻為153 Ω，添加0.06 g/L亞甲基藍實驗組表觀內阻為140 Ω，添加0.08 g/L亞甲基藍實驗組MFC表觀內阻為157 Ω，添加0.1 g/L亞甲基藍實驗組MFC表觀內阻為172 Ω，對照組的表觀內阻為290 Ω，分別比對照組降低45.1%、47.2%、51.7%、45.8%和40.6%。

由圖8可知：添加0.06 g/L亞甲基藍實驗組的氧化還原電流響應值最高，之后依次為添加0.04、0.08和0.02 g/L亞甲基藍的實驗組。CV分析證明加入0.06 g/L亞甲基藍的陽極比其他濃度的亞甲基藍能夠更好地提高大腸桿菌MFC產電性能。輸出電壓、功率密度及極化曲線和循環伏安掃描等結果表明不同濃度亞甲基藍中能夠提高大腸桿菌MFC產電性能的最佳質量濃度為0.06 g/L。

圖8 添加不同濃度亞甲基藍MFC實驗組的循環伏安曲線Fig.8 Cyclic voltammogram of the MFC with different concentration of methylene blue

ρ(亞甲基藍)/(g·L-1)00.020.040.060.080.10Pmax/(mW·m-2)18160184208178156表觀內阻/Ω290159153140157172

3 結論

電子介體對于大腸桿菌BL21(DE3)的細胞毒性從高到低依次是甲基紫精、亞甲基藍、中性紅。

比較添加相同質量濃度電子介體檢驗大腸桿菌BL21(DE3)MFC的產電性能、輸出電壓、功率密度、極化曲線和CV等，結果表明添加亞甲基藍對大腸桿菌BL21(DE3)MFC的產電性能提高最為顯著。亞甲基藍的最佳添加質量濃度為0.06 g/L，此時MFC能夠達到的最高穩定電壓值為500 mV。