四味余甘子方對高脂血癥大鼠FFA、CETP及ABCA1影響的實驗研究＊

周盼盼，楊如意

（1.青海大學醫學院 西寧 810000；2.青海大學附屬醫院 西寧 810000）

隨著社會生活水平的提高，高脂血癥已逐漸成為臨床常見的慢性疾病，發病率較前也已顯著上升，同時發病人群年齡較前明顯下降。《中國居民營養與慢性病狀況報告（2015年）》顯示，2012 年我國18歲以上成人血脂異常即高脂血癥的患病率為40.4%，其TC、TG 水平較2002年明顯增高[1]。高脂血癥是誘發心臟血管病的危險因素,尤其是當以LDL-C 或TC 升高為主時，是動脈粥樣硬化型心血管疾病的重要危險因素[2]。此外，大量研究開始提出高脂血癥和骨質疏松[3]、慢性腎病[4]等疾病進展之間的關聯，也有報道提示高脂血癥在糖尿病與牙周炎雙向關系中起著重要作用[5]。故積極防治高脂血癥有著極其重要的臨床意義。

本研究在中藏醫傳統理論指導下，在臨床應用經驗的基礎上，將余甘子（Phyllanthus emblica Linn.）、訶子（Terminalia chebula Retz.）、毛訶子Terminalia billerica(Gaertn.)Roxb.、藏茵陳（Tibetan capillaris）組方為四味余甘子方。旨在進一步明確四味余甘子方對高脂血癥模型大鼠血脂、血清ATP 結合盒轉運蛋白A1（ATPbinding cassette transporter A1，ABCA1）、膽固醇酯轉運蛋白（Cholesteryl ester transfer protein，CETP）、血清游離脂肪酸（Free fatty acid，FFA）及肝臟組織ABCA1 表達的影響，并試探討其可能的作用機制，以期對臨床防治高脂血癥有所裨益。

1 材料

1.1 動物

SPF 級SD 雄性大鼠60 只，體質量200 g±20 g，由甘肅中醫藥大學提供，許可證號：SYXK（甘）2015-0005。

1.2 藥物與試劑

四味余甘子方由余甘子、訶子、毛訶子、藏茵陳按一定比例組成。本實驗所用余甘子提取物（批號：ZL2017061201）、藏茵陳提取物（批號：ZL2017082106）、訶子提取物（批號：ZL2017082201）、毛訶子提取物（批號：ZL2017082202），均由南京澤朗生物科技有限公司提供4°C貯存備用。血脂康膠囊由北大維信生物科技有限公司生產（批號：20161110）。

脂肪乳劑配方：膽固醇2%、食用豬油10%、蛋黃粉5%、吐溫-80 0.2%、丙硫氧嘧啶1%，自制；膽固醇（批準文號：復合津Q/HG3-1288-99）由天津原四通化工廠生產；蛋黃粉由江蘇祥晟生物科技有限公司提供；吐溫80（批號：20170323A）由河南亞統食品原料有限公司提供；丙基硫氧嘧啶由武漢勝天宇生物科技有限公司提供。

TC、TG、LDL-C、HDL-C、ABCA1、CETP、FFA 還原酶試劑盒均由上海遠慕公司提供，批號均為2018012。免疫組化試劑：ABCA1：Santa Cruz 公司產品,貨號：sc-58219；鼠二抗：北京中杉金橋，貨號：sp-9002；顯色劑：DAB：北京中杉產品，貨號：ZLI-9032。

1.3 儀器

全自動血液生化分析儀：日本AU640-OlymPus。顯微鏡：日本奧林巴斯BX51T-PHD-J11。CMOS：日本奧林巴斯。多功能真彩色細胞圖象分析管理系統：美國Media Cybernetics 公司Image-Pro Plus 6.0。

2 方法

2.1 藥物及脂肪乳劑的制備

實驗時四味余甘子方以及血脂康用蒸餾水溶解，配制成相應濃度水劑備用。配制脂肪乳劑時先將定量豬油隔水融化，邊攪拌邊加入一定比例的膽固醇、蛋黃粉、丙基硫氧嘧啶，加入吐溫-80 乳化，最后以蒸餾水定容[6]備用。

2.2 分組、造模及給藥

60 只SD 大鼠按體重以隨機數字表法隨機分為6組，正常對照組、模型對照組、陽性藥物（血脂康）組、四味余甘子方低劑量組（以下簡稱為低劑量組）、四味余甘子方中劑量組（以下簡稱為中劑量組）、四味余甘子方高劑量組（以下簡稱為高劑量組）。大鼠適應性喂養1周后，除正常對照組繼續喂普通飼料外，其余各組均在喂普通飼料基礎上加以脂肪乳劑灌胃造模，劑量以1 mL·(100 g·d)-1計，正常對照組以等量生理鹽水灌胃。造模同時，血脂康組、低劑量組、中劑量及高劑量組每天分別以0.11 g·kg-1、5.4 g·kg-1、10.8 g·kg-1、16.2 g·kg-1相應藥物劑量灌胃，灌胃劑量以1 mL·(100 g·d)-1計，正常對照組及模型組每天以等量生理鹽水灌胃，共4周。

2.3 檢測指標及方法

2.3.1 檢測血脂相關指標及血清CETP、FFA

于最后一次給藥后，禁食禁水12 h后，以戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈采血，靜置，離心（3000 r，10 min），取血清，測定TC、TG、HDL-C、LDL-C、ABCA1、CETP、FFA含量。嚴格按ELISA檢測試劑盒說明進行操作。

2.3.2 檢測肝臟ABCA1

腹主動脈采血后，取出肝臟，取小于0.5 cm ×0.5 cm×0.1 cm組織塊，用4%多聚甲醛進行固定，石蠟包埋，切片，脫蠟、入水，用免疫組化法測定ABCA1。

2.4 統計學方法

采用簡明統計分析CS14.0統計軟件進行處理，數據用均數±標準差（±S）表示，多組均數比較采用單因素方差分析，兩組均數比較，方差齊時用t檢驗，方差不齊時用秩和檢驗。P＜0.05有統計學意義。

3 結果

3.1 對高脂血癥模型大鼠血脂的影響

與正常對照組比較，模型對照組TC、TG、LDL-C含量明顯升高，HDL-C含量明顯下降（P＜0.05）；與模型對照組比較，各給藥組TC、TG、LDL-C 均有所下降，LDL-C 有所升高（P＜0.05）；與血脂康組比較，低劑量組對血脂的調節作用較弱（P＜0.05）；中劑量組對TC、LDL-C的調節作用略優于血脂康組，但其對TG、HDLC的調節作用弱于血脂康組（P＜0.05）；而高劑量組對血脂的調節作用要優于血脂康組（P＜0.05）（表1）。

表1 各組血脂比較（n=10,±S）

表1 各組血脂比較（n=10,±S）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05；與血脂康組比較，ΔP＜0.05。

3.2 對高脂血癥模型大鼠血清ABCA1、CETP、FFA的影響

與正常對照組比較，模型對照組ABCA1明顯降低（P＜0.05），CETP、FFA 均明顯升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，血脂康組、低劑量組、中劑量組及高劑量組血清ABCA1均有所增加（P＜0.05），CETP、FFA均明顯下降（P＜0.01）；與血脂康組比較，低、中、高劑量組CETP、FFA 均有不同程度下降（P＜0.01），低劑量組ABCA1低于血脂康組（P＜0.05），而中劑量組、高劑量組ABCA1 均有不同程度增加（P＜0.01）；以高劑量組對ABCA1、CETP、FFA 的干預作用較顯著（P＜0.05，P＜0.01）（表2）。

表2 各組血清ABCA1、CETP、FFA的比較（n=10,±S）

表2 各組血清ABCA1、CETP、FFA的比較（n=10,±S）

注：與正常對照組比較，1*P＜0.05，*P＜0.01；與模型對照組比較，1#P＜0.05，#P＜0.01；與血脂康組比較，1ΔP＜0.05，P＜0.01。

3.3 對高脂血癥模型大鼠肝臟組織ABCA1 表達的影響

光鏡下可見，ABCA1 在大鼠肝細胞胞漿中表達，呈黃棕色。正常對照組表達廣泛，黃棕色顆粒密布，染色較深；模型對照組呈散在表達，染色較淺。經藥物干預后，各用藥組大鼠肝組織中呈黃染顆粒的陽性細胞較模型對照組明顯增多，染色均有不同程度加深，低、中、高劑量組黃染顆粒高于血脂康組（圖1）。

圖1 各組大鼠肝臟組織免疫組化ABCA1

免疫組化分析結果顯示，模型對照組大鼠肝組織中ABCA1蛋白表達量比正常對照組明顯降低，經藥物干預后，與模型對照組相比，各給藥組均能顯著升高肝組織中ABCA1的蛋白表達量（P＜0.05），其中，高、中、低劑量組均高于血脂康組，以高劑量組最為明顯（表3）。

表3 四味余甘子方對高脂血癥模型大鼠肝臟組織ABCA1表達的影響

4 討論

目前臨床治療高脂血癥的藥物主要為HGM-CoA還原酶抑制劑（他汀類）、苯氧芳酸類（貝特類）、煙酸類、膽酸螯合劑（樹脂類）、腸道膽固醇吸收抑制劑、普羅布考及n-3脂肪酸制劑。最常使用的是他汀類和貝特類，臨床降脂治療多首選他汀類。他汀類藥物可以誘導LDL-C下降，從而降低心血管疾病發病率和死亡率，主要用于治療原發性、繼發性高膽固醇血癥，目前他汀類藥物已成為高脂血癥治療的基石。但在臨床實踐中，許多患者使用他汀類藥物治療其血脂水平仍不能達標。2012 年血脂異常國際研究——中國住院患者他汀類藥物治療率88.9%，接受治療患者中，38.5%未達低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）目標值[7]，LDL-C相關的殘留風險仍然存在。而他汀類藥物的副作用有消化道反應、肝毒性、肌病、血糖升高及神經毒性等，肌病為其常見的嚴重不良反應，嚴重時可發生橫紋肌溶解，他汀類藥物導致血小板減少的案例近年也屢有報道[8-10]。其他降脂藥亦有不良反應，如貝特類藥物的不良反應主要為消化道癥狀、膽石癥、肝功損害等，與他汀類藥物聯用可發生肌病[11,12]。

由于以他汀類為代表的降脂藥并不能使高脂血癥患者的血脂均達到理想的水平，且有一定的副作用，因此，篩選具有調脂作用的中藏藥制劑，充分發揮祖國傳統醫學防治高脂血癥的優勢是當前國內中醫界共同關注的重點。目前已有大量試驗證明中藥單獨或聯用降脂藥治療高脂血癥能取得不錯甚至優于單用降脂藥的臨床效果[13-16]。故積極研究中藏藥對高脂血癥的作用并進一步探討其作用機制，對臨床防治高脂血癥有著很重要的意義。

通過對高脂血癥的深入研究，在中藏醫傳統理論指導下，課題組根據臨床應用經驗選用四味余甘子方治療高脂血癥。四味余甘子方由余甘子、訶子、毛訶子、藏茵陳組方而成。《中華人民共和國藥典》將余甘子作為藏族習用藥材收錄，藏醫藥經典著作《晶珠本草》記載余甘子被用來治療培根病、赤巴病及血病，其中血病就包括高血脂。現代藥理研究也表明，余甘子、訶子、毛訶子有一定的調脂作用[17,18]，已有研究提出毛訶子、藏茵陳具有一定的肝臟保護作用[19,20]。

本次研究結果表明，四味余甘子方對高脂血癥模型大鼠的血脂有調節作用，且以高劑量組作用最為顯著。同時通過對各組血清CETP、FFA 的檢測，最終表明各給藥組CETP、FFA 均有不同程度降低，且以高劑量組降低最為明顯,療效優于血脂康組。

CETP 是一種血漿糖蛋白，在調節HDL-C 和膽固醇逆向轉運中發揮重要作用，能介導膽固醇酯與甘油三酯在HDL、VLDL和LDL之間進行轉運，以調節脂代謝。有大量研究證實使用CETP 抑制劑，在降低LDLC和升高HDL-C 兩個方面均有效果，可以在一定程度上改善高脂血癥[21-24]。本研究結果顯示，四味余甘子方可降低高脂血癥模型大鼠CETP，該方對血脂的調節作用或與其抑制CETP有關。

FFA 是一種由脂肪組織內TG 水解釋放的非酯化脂肪酸，可作為許多器官的直接能量來源，并可由肝臟轉化為酮體，對脂質代謝有一定影響。已有研究提出FFA 可以上調3-巰基丙酮酸硫轉移酶（MPST），MPST可通過抑制CSE/H2S（胱硫醚γ-裂解酶/硫化氫）和隨后上調的固醇調節元件結合蛋白1c通路（SREBP-1）、c-Jun 氨基末端激酶磷酸化（JNK）和肝臟氧化應激途徑促進脂肪變性，導致脂肪肝[25]。本研究結果顯示，四味余甘子方可降低血清FFA，調節脂質代謝，效果優于血脂康組，高劑量組效果較好。

本研究通過檢測各組大鼠血清ABCA1 以及肝臟組織ABCA1，以期明確四味余甘子方對ABCA1表達的影響，最終得出結論：四味余甘子方能增加ABCA1 的表達，以高劑量組最為明顯，且優于血脂康組，其對血脂的調節作用或與其增強ABCA1表達相關。

ABCA1 是由12 個跨膜結構域和兩個ATP 結合盒（ABC）結構域組成的包括2261 個氨基酸的整合膜蛋白，主要分布在巨噬細胞和肝臟細胞，是膽固醇和磷脂從細胞流出到高密度脂蛋白（HDL）顆粒的關鍵調節因子[26,27]，ABCA1 可以介導細胞游離膽固醇和磷脂流向細胞外受體載脂蛋白AI（apoAI），以形成新的HDL[28]。有研究提出ABCA1 介導的HDL 形成過程在早期動脈粥樣硬化病變發展中起著至關重要的作用，當ABCA1表達下調時會促進動脈粥樣硬化的發展[29,30]。

ABCA1受肝X受體（LXRs）、過氧化物酶體增殖因子活化受體（PPARs）和視黃酸X受體（RXRs）的調控[31]，LXRs 和PPARs 是與RXRs 形成專性異二聚體的核受體成員，LXRs 與RXRs 的協同作用可以調節肝細胞和巨噬細胞中參與脂質代謝基因的表達，LXRs在高細胞固醇負荷條件下被激活，并誘導膽固醇外排轉運蛋白ABCA1和ABCG1（ATP-結合盒轉運蛋白G1）的表達以促進過量細胞膽固醇的外排[32]。PPARs 分為PPARα、PPARβ、PPARγ三型，PPARα激活后通過減少肝臟中的LXR/RXR異二聚化可以抑制LXRs信號傳導。還有研究提出前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin9型（PCSK9）可以通過下調ABCA1基因和ABCA1蛋白表達對ABCA介導的膽固醇流出起直接抑制作用[33]。

綜上，四味余甘子對高脂血癥模型大鼠的血脂有較明顯的調節作用，能顯著降低血清CETP 及FFA 水平，增強ABCA1 的表達。其更深入的作用機制，以及可能存在的其它作用途徑，亟待進一步研究。