MANF蛋白對乙型肝炎患者肝臟纖維化程度的診斷效果分析

劉琴 時建國

慢性乙型肝炎(chronic viral hepatitis B，CHB)是一種肝臟疾病，在臨床上極為普遍，慢性乙肝病毒(HBV)感染是其主要致病因素，隨著患者病情的發展，患者可出現各類的肝臟病變，其中肝臟纖維化在患者中比較常見[1]。及時了解患者是否存在肝纖維化及纖維化程度是治療此類患者的關鍵[2]。以往相關報道表明[3]，內質網(endo-plasmic reticulum，ER)會產生應激，主要原因是機體內HBV一直進行復制及表達，并且ER應激會影響受HBV感染后機體肝臟內不可控制的炎癥的變化和發展，但準確的調控機制仍需繼續探討。中腦星形膠質細胞源性神經營養因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF)蛋白是一種以高爾基體和內質網為主要編碼區域的分泌性蛋白。目前研究[4-5]認為，ER應激可以提高MANF基因的表達水平和蛋白的分泌水平，MANF蛋白高表達可能有助于抑制肝臟受到損傷后的過度炎癥及纖維化反應，但MANF蛋白表達水平是否與慢性HBV感染后肝臟纖維化的發生發展密切相關目前鮮有報道[6]。本研究通過檢測我院接收的乙肝患者外周血MANF蛋白的表達情況，來探究MANF蛋白對乙肝患者肝臟纖維化程度的診斷效果。

資料與方法

一、一般資料

選取2016年9月至2017年9月96例我院接收的乙肝患者進行研究，其中女性42例，男性54例，年齡25～52歲，平均年齡(29.2±18.5)歲，將上述患者按照肝纖維化程度分為輕度肝纖維化組、中度肝纖維化組、重度肝纖維化組。同時選取50例在我院體檢后顯示健康者作為對照組，其中女性29例，男性21例，年齡22～52歲，平均年齡(26.6±15.4)歲。乙肝患者與對照組在性別和年齡比較不具有統計學意義，具有可比性(P>0.05)。

納入標準：(1)所有患者均經病理確診為乙肝病毒感染。(2)所有患者均自愿加入研究。

排除標準：(1)并發嚴重的心臟、肝臟及腎臟疾病；(2)由于其他原因引發的肝功能障礙患者；(3)并發類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡等風濕性免疫系統疾病；(4)并發甲亢或糖尿病等患者。

二、方法

(一)ELISA法檢測MANF蛋白水平 采集乙肝患者以及體檢健康者空腹時的外周血5 mL，將血清分離出，于零下80℃的環境下保存備用。使用MANF檢測試劑盒進行樣本檢測，步驟如下：①檢測標本分別設置待測樣本孔、標準孔和空白孔，將50 μL待測樣本分別加入相應的檢測孔中，在37℃下培育2 h，倒掉剩余液體并將標本甩干；②在每個檢測孔中加入50 μL檢測溶液A，在37 ℃下培育1 h；③倒掉檢測孔中的液體，在每個檢測孔中加入180 μL洗滌液，浸泡2 min，將酶標板內液體甩掉或吸去，重復洗滌3～4次；在檢測孔中加入50 μL檢測溶液B，在37℃環境下培育0.5 h；接著倒去檢測孔內液體并甩干，將酶標板清洗4-5次；④在每個檢測孔內加入45 μL底物溶液，在37 ℃下避光顯色20分鐘，在每個測試孔中加入25 μL終止液，將反應終止，藍色立即轉變為黃色；⑤用酶標儀在450 nm波長測量各檢測孔的光密度值。

(二)病毒學指標和生化指標檢測 采用實時熒光定量PCR檢測HBV DNA，采用生化分析儀及相應試劑分別檢測谷天門冬氨酸轉氨酶、血清總膽紅素、谷丙轉氨酶，采用雅培化學發光法檢測乙肝五項定量，采用血球分析儀檢測血小板。

(三)肝臟活組織檢查及診斷 采用1 s快速穿刺活檢術在超聲的引導下穿刺獲取肝臟組織，長度2 cm左右，由HCHO固定，石蠟包埋，并連續切片，經染色后由光學顯微鏡觀察，并分別由兩名醫師進行閱片診斷。

(四)評價方法 采用受試者工作特征(ROC)曲線及AUC評價指標進行評價分析，需計算FIB-4和APRI，FIB-4和APRI，以便較好地對乙肝患者肝纖維化程度進行評估。FIB-4指數基于谷丙轉氨酶、天門冬氨酸轉氨酶、血小板和患者年齡進行計算，FIB-4=(年齡×天門冬氨酸轉氨酶)/(血小板×谷丙轉氨酶的平方根)。APRI評分計算方法：APRI=[天門冬氨酸轉氨酶/ULN×100)/血小板(109/L)]，其中ULN為天門冬氨酸轉氨酶正常參考值上限[7]。

三、統計學方法

結 果

一、肝纖維化不同程度的乙肝患者外周血MANF蛋白的表達

對照組MANF蛋白的表達水平為(1.45±0.56)，輕度肝纖維化組MANF蛋白的表達水平為(1.75±0.84)，中度肝纖維化組MANF蛋白的表達水平為(1.85±1.02)，重度肝纖維化組MANF蛋白的表達水平為(2.21±1.12)，四組之間MANF蛋白的表達水平比較存在明顯差異，具有統計學意義(P<0.05)，兩組之間分別比較，與對照組相比，其他三組患者MANF蛋白的表達水平比較差異顯著，均具有統計學意義(P<0.05)；與輕度肝纖維化組比較，重度肝纖維化組MANF蛋白的表達水平存在差異，具有統計學意義(P<0.05)；與中度肝纖維化組比較，重度肝纖維化組MANF蛋白的表達水平比較差異具有統計學意義(P<0.05)。但輕度肝纖維化組與中度肝纖維化組MANF蛋白的表達水平差異不具有統計學意義(P>0.05)。外周血MANF蛋白的表達水平與肝纖維化程度呈正相關(r=0.401,P<0.05)。

二、乙肝患者外周血MANF蛋白的表達水平與臨床各個指標的相關性

根據谷丙轉氨酶水平、乙肝病毒表面抗原水平、總膽紅素水平、HBV DNA、乙肝E抗原狀態及天門冬氨酸轉氨酶水平，將96例患者進行分組，結果如下：乙肝病毒表面抗原<1 500 IU/mL時，MANF值為(2.15±0.61)，在1 500～20 000 IU/mL時，MANF值為(2.31±0.55)，>20 000時，MANF值為(2.23±0.53)；乙肝E抗原呈陰性時，MANF值為(2.24±0.56)，呈陽性時，MANF值為(2.21±0.55)；谷丙轉氨酶<80 U/mL時，MANF值為(2.16±0.58)，在80～250 U/mL時，MANF值為(2.13±0.53)，在>250 U/mL時，MANF值為(2.23±0.65)；在HBV DNA<1 000 IU/mL時，MANF值為(2.16±0.51)，在1 000～100 000 IU/mL時，MANF值為(2.17±0.62)，在>100 000 IU/mL時，MANF值為(2.24±0.52)；天門冬氨酸轉氨酶<80 U/mL時，MANF值為(2.12±0.55)，在80～250 U/mL時，MANF值為(2.46±0.59)，在>250 U/mL時，MANF值為(2.58±0.41)。結果提示在不同臨床指標條件下分組進行比較時，不同天門冬氨酸轉氨酶、谷丙轉氨酶水平組間MANF蛋白的表達水平比較均具有明顯差異，具有統計學意義(P<0.05)。

三、MANF蛋白對乙肝患者肝纖維化診斷效果的ROC研究

將96例乙肝患者以肝臟病理結果為金標準進行分組，重度肝纖維化40例，顯著肝纖維化56例，分別進行ROC研究。MANF蛋白診斷顯著肝纖維化的敏感度為0.647，,特異度為0.691，而診斷重度肝纖維化時的敏感度為0.931，特異度為0.467，與顯著纖維化相比，診斷重度纖維化時敏感度增加，特異度降低。根據ROC研究整理圖像信息，見表1。

討 論

據以往相關報道說明，HBV的持續感染極易觸發ER發生應激反應，但關于患者HBV慢性感染后肝纖維化的進一步發展以及肝臟情況中是否有MANF的參與方面的報道比較缺乏。有關研究人員猜測，MANF在患者由肝炎轉變為肝硬化的過程中極有可能起著重要作用[8]。因此，本研究針對不同纖維化程度的乙肝患者外周血中MANF蛋白的表達水平進行了檢測。

表1 MANF蛋白對乙肝患者肝纖維化診斷效果的ROC研究

研究結果顯示，外周血MANF蛋白的表達水平與肝纖維化程度呈正相關；與體檢健康者對照組相比較，輕度纖維化組、中度纖維化組與重度纖維化組MANF蛋白的表達水平差異具有統計學意義(P<0.05)；同時不同AST、ALT水平組間差異具有統計學意義(P<0.05)。根據本研究可知，MANF蛋白在肝纖維化階段表達水平最高，ER應激可以上調MANF蛋白表達水平，推測ER應激作為一種因素參與了纖維化的進程。適度的ER應激是細胞的自我保護的一種方式，但過度的ER應激，則會導致細胞凋亡過度。推測在慢性HBV感染的早期階段，即肝臟炎癥和纖維化階段，ER應激導致的MANF蛋白表達水平較高對肝纖維化發生發展起到一種保護作用，但當慢性HBV感染引起的持續的免疫損傷導致廣泛假小葉形成時，肝細胞則呈現過度凋亡，ER應激不再是疾病發生發展的主要機制，因此，MANF蛋白表達水平下降[9]。我們根據ROC研究，探究MANF蛋白對乙肝患者肝臟纖維化程度的診斷效果，并將其與FIB-4和APRI指數進行比較，得出MANF蛋白診斷重度肝纖維化時的敏感度為0.931，特異度為0.467，而診斷顯著肝纖維化的敏感度為0.647，特異度為0.691，與顯著纖維化相比，診斷重度纖維化時敏感度增加，特異度降低，但可以與FIB-4和APRI指數形成互補，達到良好的診斷效果。

綜上所述，MANF蛋白參與乙肝患者肝纖維化程度進展，可有效評估乙肝患者肝纖維化程度。