CoCl2化學模擬肝癌體外缺氧模型的建立及對HIF-1α、VEGF基因的影響

翁苓苓 高玲 張閩光

肝癌本身快速增殖的生物學特征造成了缺氧的微環境，其與腫瘤發展、浸潤、轉移等惡性生物學行為密切相關，導致腫瘤治療失敗和預后不良[1]。缺氧誘導因子-1(HIF-1)在肝癌的侵襲、轉移中起著重要的作用，但因HIF-1α在常氧下易降解[2]，使這種研究遇到困難。因此，建立體外細胞穩定的缺氧模型可為肝癌的缺氧環境及防治血管新生等實驗研究提供平臺。常規的缺氧模型為物理性缺氧如低張性低氧，其模型特點需要低氧的狀態平衡與維持，而化學模擬誘導缺氧環境簡單易行，更利于快速建立急性缺氧的模型。本研究就CoCl2作用常見的肝癌細胞系模擬化學性缺氧的最佳條件展開探索。

資料與方法

一、實驗細胞和材料

(一)細胞 人肝癌細胞系HepG2、Hep3B、SMMC-7721和 Bel-7402，購于美國菌種保藏中心(ATCC)。

(二)試劑 胎牛血清(Gibco公司)；DMEM培養基(美國Hyclone)；雙抗(青霉素-鏈霉素)(美國Gibco公司)；胰酶(美國Sigma公司)；CCK-8試劑盒(上海博谷生物科技有限公司)；氯化鈷(sigma,C8661)；HIF-1α抗體(BD,610958)；VEGF引物 (CST)；PCR提取試劑(日本TAKARA)；PCR定量試劑盒(日本TAKARA)。

二、實驗方法

(一)細胞培養 用含有10%的胎牛血清、谷氨酰胺的DMEM培養液，于37 ℃飽和濕度、5% CO2濃度下培養。

(二)建立低氧模型 將對數生長期的四種細胞種植在96孔板內，根據每種細胞生長情況調整細胞濃度，每孔200 μL培養基，設常氧氣對照組(加入正常培養液)，實驗CoCl2組(分設100、200、300、400、500、600、700、800 μmol/L)，每組5個復孔。

(三)CCK-8法細胞增殖實驗 取對數生長期的肝癌細胞懸液，以每孔5×103個細胞接種于96孔培養液，每孔培養液為200 μL。每組設5個復孔，37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養，按照碧云天CCK-8試劑盒說明書進行操作，加入不同濃度CoCl2處理肝癌細胞，每孔加入10 μg CCK-8，輕搖，37 ℃下孵育3 h，用酶聯免疫儀記錄450 nm 波長處的吸光度(A)值。分別做5個復孔，實驗重復3次。

(五)RT-PCR檢測 四種肝癌細胞在5%CO2、37℃條件下培養，處于對數生長期的細胞，加入200 μmol/L CoCl2分別作用于四種肝癌細胞系，常氧下加入培養液作為空白對照組，5% CO2、37 ℃繼續培養胞0、6、12、24 h后，按照TRIzol說明方法提取細胞RNA，測總RNA濃度和純度。按反轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA。以β-actin為內參,VEGF引物序列正義鏈：AATCGAGACCCTGGTG-GACA，反義鏈：TGTTGGACTCCTCAGTGGGC。PCR反應條件：94 ℃預變性30 s，94 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s共40個循環。2-△△CT法計算mRNA的相對表達。每個實驗組重復3次。

(六)Western blot檢測 四種肝癌細胞在5%CO2、37 ℃條件下培養，處于對數生長期的細胞，分別加入含100、200、300、400 μmol/L 的CoCl2的DMEM培養液培養24 h，提取總蛋白后測定蛋白濃度。蛋白裂解液裂解細胞后提取細胞總蛋白。BCA法測定蛋白濃度。丙烯酰胺垂直電泳，半干轉膜法轉至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封密1 h。加一抗稀釋液4 ℃孵育過夜。PBST緩沖液洗膜10 min×3次。加入不同稀釋比的二抗稀釋液室溫孵育1 h，PBST緩沖液洗膜10 min×3次。ECL化學發光，暗室膠片顯影后，Image-Pro Plus 5.0軟件計算條帶光密度值。

三、統計學方法

結 果

一、氯化鈷對四種肝癌細胞存活率的影響

為了研究在CoCl2處理誘導的缺氧模擬條件下對常見的肝癌細胞生長的影響，將四種肝癌細胞加入不同濃度的CoCl2(0～800 μmol/L)。CoCl2濃度的選擇是既能滿足實驗低氧條件，又保證細胞存活率較高作為細胞缺氧的實驗的標準，排除藥物對于細胞較大的急性毒性，同時保證藥物能夠發揮最大作用。實驗選用不同濃度的CoCl2作用于四種肝癌細胞，24 h后檢測細胞的吸光度值。實驗結果顯示，加入不同濃度的CoCl2后四種肝癌細胞存活率不同程度地減低，CoCl2濃度在100～200 μmol/L時四種肝癌細胞的生長無明顯減低，當濃度高于200 μmol/L后，四種人肝癌細胞存活率明顯降低(P<0.05，見圖1)。

選取100、200、300、400 μmol/L濃度的CoCl2作用四種肝癌細胞0、12、24、48、72 h后檢測細胞的吸光度值，結果顯示，CoCl2作用四種肝癌細胞48、72 h后細胞存活率顯著降低(P<0.05，見圖2)。表明CoCl2>200 μmol/L，作用時間>24 h后呈劑量和時間依賴性地抑制肝癌細胞活力，而濃度在200 μmol/L以內的CoCl2未嚴重影響細胞的活力。

圖1 不同濃度CoCl2對四種肝癌細胞存活率的影響

二、氯化鈷作用四種肝癌細胞不同時間后VEGF mRNA的表達

根據CoCl2對細胞活性增殖的影響，選取濃度為200 μmol/L的CoCl2作用四種肝癌細胞最佳誘導濃度，作用0、6、12、24 h后檢測VEGF mRNA相對表達量。結果顯示，在CoCl2作用24 h時四種肝癌細胞VEGF mRNA表達均明顯增加(P<0.05)。故選用的時間為24 h作為CoCl2誘導低氧的時間。見圖3。

注：A:Bel-7402肝癌細胞；B:Hep3B肝癌細胞；C:SMMC-7721肝癌細胞；D:HepG2肝癌細胞

圖2CoCl2作用四種肝癌細胞不同時間后的細胞存活率

注：A:Bel-7402肝癌細胞；B:Hep3B肝癌細胞；C:SMMC-7721肝癌細胞；D:HepG2肝癌細胞。與對照組(作用0 h肝癌細胞內VEGF mRNA)比較，▲P<0.05

圖3CoCl2對四種肝細胞VEGFmRNA相對表達量的影響

三、氯化鈷對四種肝癌細胞HIF-1α蛋白表達的影響

不同濃度培養氯化鈷作用于四種肝癌細胞24 h，提取總蛋白，進行Western Blot的檢測。結果顯示，未加入氯化鈷時HIF-1α蛋白未見明顯表達；當氯化鈷濃度為100 μmol/L時，Bel-7402細胞HIF-1α蛋白表達；當氯化鈷濃度為200 μmol/L時，四種肝癌細胞HIF-1α蛋白均表達。故綜合氯化鈷對細胞存活率的影響，氯化鈷濃度為200 μmol/L可作為穩定HIF-1α表達的缺氧模型的濃度。

圖4 不同濃度CoCl2作用四種肝癌細胞24 h后HIF-1α蛋白的表達

討 論

CoCl2是常見的化學模擬缺氧條件的化學物質，其通過鈷的累積穩定HIF-1α表達來模擬缺氧[3]，與氧水平無關，因此該方法具有比常規缺氧模型更穩定的優點。此外，已經證明CoCl2能調節缺氧導致相關的下游靶標如促紅細胞生成素和葡萄糖轉運蛋白1(GLUT1)的作用，具有與真正的缺氧相同的調節作用[4]。

CoCl2對不同的細胞誘導HIF-1α表達所需的濃度及處理時間有所不同。高濃度或長時間作用細胞會誘導細胞的凋亡[5]。CoCl2能上調HIF-1α，并促進VEFG等下游基因表達[6-7]。本研究提示，氯化鈷對四種肝癌細胞均產生細胞毒性作用，并隨著藥物濃度增加而增強。在CoCl2濃度超過200 μM時及作用24 h后細胞存活率明顯減低。同時發現200 μM CoCl2作用四種肝癌細胞24 h后細胞內VEGF mRNA表達水平最高，肝癌細胞也較能穩定表達HIF-1α蛋白。本研究表明，四種常見的肝癌細胞在200 μM CoCl2作用24 h時，對細胞既有較小的細胞毒性，也能使得肝癌細胞較穩定表達HIF-1α，因此200 μM CoCl2作用24 h 為肝癌化學性缺氧誘導的最佳條件。

與其他體外模型一樣，這個簡化的平臺相對有限地反映了體內腫瘤微環境，它缺乏體內的復雜性、細胞成分的多樣性(包括免疫細胞和器官特異性基質細胞，以及細胞外基質成分)。然而，與依賴于物理低氧的常規缺氧模型相比，基于CoCl2的平臺可以簡單易行地模擬腫瘤缺氧微環境，為肝癌細胞的缺氧、血管新生的研究提供了細胞模型基礎。