氧化苦參堿對非酒精性脂肪性肝炎大鼠的保護作用及機制研究

齊慧慧 覃霞

近年來，非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)已成為全球常見的慢性肝病，其中有10%～30%的患者可進展為非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)[1-2]。氧 化 苦 參 堿 (oxymatrine，OMT)是中藥苦參的主要成分，含量豐富，提取簡單。目前研究指出槐果堿、布渣葉、抗脂方、姜黃素等藥物對NASH有治療作用[3-6]。但氧化苦參堿對實驗性大鼠NASH是否有治療作用尚未有報道。

資料與方法

一、一般資料

(一)動物及飼料 30只6 周齡SD大鼠，SPF 級，體質量 200～220 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司[動物生產許可證號：SCXK(滬)2012-0002]。實驗動物飼養于海軍軍醫大學動物房。普通飼料購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，高脂飼料(88%基礎飼料+10%豬油+2%膽固醇)購于南通特洛菲飼料科技有限公司。

(二)藥物及試劑 OMT購自蘇州醫藥有限公司，批號 20100410；水合氯醛購自上海展云化學試劑有限公司；油紅O、HE染色相關試劑購于蘇州中芯啟恒有限公司；ALT、AST檢測試劑盒購于南京宏哲生物試劑耗材公司;TC、TG、HDL、LDL檢測試劑盒、IL-6、TNF-α單克隆抗體、TGF-β1 單克隆抗體購自武漢博士德生物工程制劑公司。

(三)儀器 精密電子天平(Mettler Toledo公司)；—85℃超低溫冰箱(Harris公司)；低溫離心機(德國Pharmacia公司)；紫外分光光度儀(Pharmacia公司)；恒溫水浴振蕩器HZS-H型、回轉式切片機(哈爾濱東聯有限公司)；Olympus A H-2型顯微鏡(日本Olympus公司)；電熱干燥箱KWY-450型、(武漢實驗儀器廠)；紫外分光光度儀80210620型(德國Pharmacia公司);擴增儀 BiometraU NOIIT hermocyclerT 3 型(BiometraU NOII 公司產品)；瓊脂糖凝膠電泳儀 FD201 型(北京 61 儀器廠產品)。

二、實驗方法

(一)氧化苦參堿溶液配比 將適量的氧化苦參堿粉末溶于水中搖勻，配比成8 mg/mL的氧化苦參堿溶液。

(二)動物分組和處理 將SD大鼠隨機分成 3組，分別為空白對照組(10只)、模型組(10只)、OMT治療組(10只)。空白對照組給予普通飲食，模型組OMT治療組均給予高脂飲食16周，并于第8周末分別給予同等量的生理鹽水、氧化苦參堿溶液灌胃；第16周末，將所有SD大鼠禁食12 h后稱重，麻醉、取下腔靜脈血，分離血清，并稱肝重；肝臟稱重后部分液氮凍存,部分4%多聚甲醛固定。根據大鼠肝指數、脂肪變、纖維化診斷標準證實模型組NASH模型造模成功。

(三)血清指標檢測 切取全部肝臟，稱肝重，計算肝指數(肝指數 = 肝臟質量/體質量×100% )；運用自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase、ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase、AST)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三脂(triglyceride、TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein、HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein、LDL)變化。

(四)肝組織相關炎癥因子mRNA表達檢測 用RT-PCR技術檢測大鼠肝組織中白介素-6(interleukin-6、IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α、TNF-α)和轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)mRNA表達水平。

(五)肝臟病理 將石蠟包埋的肝組織，行 HE 染色、V-G 染色、蘇丹Ⅲ染色觀察肝組織炎癥反應程度、纖維沉積情況及脂肪變性程度。

三、統計學分析

結 果

一、對大鼠質量、肝指數的影響

第16周，所有SD大鼠均無死亡；第16周末，模型組大鼠體重、肝指數均高于對照組(P<0.01)，OMT治療組大鼠體重、肝指數低于模型組(P<0.01)。見表1。

表1 3組大鼠終末體重和肝指數比較(±s，n=10)

注：與對照組比較，*P<0.01；與模型組組比較，#P<0.01

二、對大鼠肝功能的影響

三、與正常組比較組比較，模型組大鼠血清 ALT、AST明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，OMT治療組 ALT、AST明顯降低(P<0．01)。見表 2。

表2 各組大鼠肝功能指數比較(±s)

注：與對照組比較，*P<0.01；與模型組組比較，#P<0.01

三、對大鼠血脂的影響與正常組比較，模型組大鼠血清 TC，TG，LDL-C 水平均顯著升高(P<0.05)，HDL-C 含量下降(P<0.05)。與模型組比較，氧化苦參堿治療組大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C 含量水平無明顯下降(P>0.05)。見表 3。

四、對大鼠肝組織IL-6、TNF-α mRNA表達的影響與正常組比較，模型組大鼠肝組織 IL-6、TNF-α、TGF-β1 mRNA 的表達明顯增加(P<0.01)。與模型組比較，氧化苦參堿治療組大鼠肝組織 IL-6、TNF-α、TGF-β1 mRNA 的表達明顯增加(P<0.01)。見圖1。

表3 各組大鼠血脂指標變化(±s)

注：**P<0.05,與對照組比較；##P<0.05與模型組組比較

注：*P<0.01,**P<0.05與對照組比較；#P<0.01與模型組組比較

圖1各組大鼠肝組織mRNA表達比較

五、對大鼠肝組織病理形態學影響

與空白組計較，模型組大鼠肝組織HE 染色、蘇丹Ⅲ染色、V-G 染色顯示肝組織炎癥、脂肪變性程度、纖維化程度明顯加重。與模型組比較，OMT治療組大鼠肝組織HE 染色顯示肝組織炎癥反應程度明顯減輕；蘇丹Ⅲ染色顯示肝細胞脂肪變性程度明顯減輕；V-G 染色顯示肝組織纖維化程度明顯減輕。見圖2。

圖2 OMT對小鼠肝臟形態學變化的影響(HE×400)

討 論

目前多項研究證實中藥對NASH有較好的治療作用。氧 化 苦 參 堿 是傳統中藥草本苦參的主要有效單體，含量高，提取較易，結構與槐果堿類似。有研究表明槐果堿有改善實驗性大鼠肝功能、抑制炎癥因子、減輕肝纖維化程度、抗腫瘤的作用[7-10]。但尚未有關于氧化苦參堿對NASH的治療研究。本實驗通過高脂飲食成功建立大鼠NASH模型，并通過給與氧化苦參堿灌胃觀察是否有保護作用及機制探討。

在NASH發病機制中認為，過量的熱量或不適當的攝入增加了肝細胞中的有害游離脂肪酸(free fattyacids，FFA)和脂代謝物(LPC、膽固醇和神經酰胺)的生成，導致肝脂肪變性和肝細胞損傷[11-12]。本研究結果顯示OMT可顯著降低NASH大鼠的血清ALT、AST水平；HE 染色、蘇丹Ⅲ染色顯示OMT治療組大鼠肝組織炎癥反應程度、肝細胞脂肪變性程度明顯減輕；這可能與OMT保護肝細胞、減少肝細胞中有害FFA和脂代謝物的生成、減輕肝脂肪變性相關。本研究結果還發現，OMT可顯著下調肝組織中 IL-6、TNF-α、TGF-β1 mRNA 的表達，這可能與其減少肝臟庫普弗細胞(Kupffer cell)的炎癥反應和肝星狀細胞(hepatic stellate cells ,HSCs)的纖維化反應導致的炎癥因子產生減少密切相關，從而進一步緩解肝臟的炎癥及纖維化進展，本實驗OMT治療組大鼠V-G 染色顯示肝組織纖維化程度明顯減輕也進一步證實了這點。總之，OMT對大鼠NASH 進程有顯著保護作用，可能與其能改善肝功能，抑制炎癥因子表達，減輕肝細胞脂肪變性及肝纖維化相關。