SB-525334下調肝星狀細胞miR-19b和miR-29b的表達

吳江華 馬俊驥 郭昱 郭平

肝纖維化進展時轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)可以促使肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSC)產生大量膠原沉積[1]。肝硬化后miR-29b和miR-19b表達均下調，TGF-β1可抑制miR-29和miR-19b的表達，給予miR-19b 和miR-29類似物可以抑制HSC 活化，并減輕肝纖維化的發生[2,3]。SB-525334 是一種強效小分子抑制劑，能夠選擇性抑制TGF-β I型活化素受體樣激酶(activin receptor-like kinase,ALK5)[4]。研究表明，SB-525334 可以選擇性地抑制TGF-β1 受體從而抑制TGF-β介導的慢性腎損傷，但是SB-525334 對HSC的作用機制還不清楚。本研究觀察TGF-β1 刺激HSC后SB-525334 對I 型膠原分泌、miR-29b和miR-19b表達的影響，以評估SB-525334 在肝纖維化防治中的作用。

資料與方法

一、細胞培養及MTT

HSC株人LX-2由美國Mount Sinai大學醫學院惠贈。將LX-2細胞系于液氮中取出，迅速置于37℃水浴鍋中，用含10%FBS、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基重懸細胞，并接種于培養瓶中，在體積分數為0.05的CO2孵箱中37℃恒溫培養。取處于對數生長期的細胞用于實驗[5]。

收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，在96孔培養板中每孔加入100 μL，鋪板使待測細胞調密度 1×104個細胞/孔。體積分數為0.05的CO2、37℃孵育培養24 h，2% FBS培養基饑餓12 h，加入濃度梯度的干預因子，繼續培養24 h，設5～7個梯度，3～5個復孔。每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續培養4 h。每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀A490 nm處測量各孔的吸光值。同時設置調零孔和對照孔。根據吸光度值計算各TGF-β1不同干預濃度與干預時間的增殖率，以及SB-525334不同干預濃度與干預時間的抑制率。增殖率=(實驗組-空白組)/(對照組-空白組)，抑制率=1-(實驗組-空白組)/(對照組-空白組)。為明確TGF-β1與SB-525334 處理LX-2細胞時最佳濃度，以未做任何處理的LX-2 細胞作為對照，分別觀察TGF-β1在濃度為1、10、20、30 ng/mL時處理后LX-2細胞生長率、SB-525334在濃度為1、2、10、20 μmol/L時處理后的LX-2細胞生長率。為明確TGF-β1與SB-525334處理LX-2細胞最適時間，觀察TGF-β1 、SB-525334在0、12、24、48 h處理后LX-2細胞生長率。

二、細胞分組與干預

將LX-2細胞種植于6孔培養板上，每孔約5×105個細胞，在10% FBS的DMEM中進行培養24 h，待細胞融合度達到60%時，改用1% FBS的DMEM饑餓處理12 h，分別設對照組、TGF-β1干預組、SB-525334 干預組、TGF-β1和SB-525334共同干預組，其中TGF-β1和SB-525334共同干預組先加入SB-525334，12 h后再加TGF-β1，在各組干預過程中均加入相同劑量的溶劑(DMSO、檸檬酸與BSA)，CO2孵育箱培養24 h后，收集細胞。

三、蛋白質印跡法檢測I型膠原

采用RIPA裂解緩沖液制備細胞蛋白裂解液，-20℃保存。BCA法測定蛋白濃度，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品，PVDF膜轉膜。PVDF 膜置于含5%脫脂奶粉的TBST封閉液中于室溫封閉1 h，將封閉后的PVDF膜置入TBST適當稀釋的一抗溶液中，4℃過夜。以TBST 1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗溶液中，于37℃反應1 h。實驗用X膠片顯影后采用Image J軟件對結果進行定量分析，灰度值以累積吸光度值(IA)表示。

四、RT-qPCR檢測miR-19b和miR-29b

吸除培養基，用PBS洗滌細胞，加入含有0.10%～0.25%胰蛋白酶處理，將細胞懸液轉移至RNase-Free的離心管中，300×g離心5 min，收集細胞沉淀。采用美國Ambin公司的mirVanaTMPARIS試劑盒提取miRNA，進行濃度及純度測定后行miRNA反轉錄。

miRNA SYBR Green 熒光定量PCR以cDNA為模板檢測miR-29b和miR-19b的表達水平，其引物序列如下，miR-19b：UGUGCAAAUCCAUGCAAAC-UGA，miR-29b：UAGCACCAUUUGAAAUCAG-UGUU；U6上游引物序列：CTCGCTTCGGCAG-CACA，下游引物序列：AACGCTTCACGAAT-TTGCGT，均由天根生化科技有限公司合成，引物濃度均為10 μmol/L。

PCR產物的相對定量使用比較閾值法進行定量分析。Ct值是指熱循環儀中熒光達到熒光閾值所需的循環數，在測定目的基因Ct值的同時，測定同一樣本內參基因的Ct值，從而對加入RNA量的差異進行校正。△Ct實驗組=Ct目的基因-Ct內參基因，△Ct對照組=Ct目的基因-Ct內參基因，△△Ct=△Ct實驗組-△Ct對照組，2-△Ct表示目的基因的相對表達量，2-△△Ct表示實驗組的目的基因相對于對照組的變化倍數。

五、統計學方法

計量資料以均數±標準差表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間比較采用SNK檢驗、Tamhane’st2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、SB-525334抑制HSC增殖

TGF-β1 的濃度為1、10、20、30 ng/mL時，吸光度值為0.44±0.02、0.58±0.32、0.54 ±0.07、0.46±0.05，與對照組比較，細胞增殖以濃度依賴的方式呈現先增高后下降的趨勢(P<0.05)，當TGF-β1濃度為10 ng/mL時，其生存率最高，為132.0%。SB-525334在濃度為1、2、10、20 μmol/L，吸光度的數值為0.53±0.05、0.51 ±0.04、0.41±0.05，0.40±0.06，SB-525334處理后與對照組比較，細胞抑制率以濃度依賴的方式呈現逐漸升高的趨勢(P<0.05)，當SB-525334濃度為10 μmol/L時，其抑制率最強，為38.4%。

TGF-β1在0、12、24、48 h時，其吸光度值為0.27±0.07、0.29 ±0.07、0.31±0.07、0.30±0.06；SB-525334在0、12、24、48 h時其吸光度值0.32±0.07、0.3 ±0.06、0.28±0.06，0.30±0.06，TGF-β1與SB-525334在各個時間段對細胞的增殖無顯著差異(P>0.05)，但是在24 h時兩種藥物對細胞的影響呈最大的趨勢，因此選擇藥物處理24 h進行后續試驗。

二、SB-525334抑制I型膠原的表達

對照組、TGF-β1組、SB-525334組、TGF-β1+SB-525334組I型膠原蛋白相對表達量分別為(17.89±4.27)%、(82.80±4.39)%、(34.63±5.37)%、(62.62±3.72)%，TGF-β1組I型膠原蛋白的表達量較對照組顯著增高(P<0.01)，SB-525334組和TGF-β1+SB-525334組I型膠原蛋白的表達量較TGF-β1顯著降低(P<0.01)，見圖1。

注：1.對照組；2.TGF-β1干預組；3.SB-525334干預組；4.TGF-β1和SB-525334共同干預組

圖1SB-525334對肝星狀細胞株LX-2 細胞I型膠原表達的影響

三、SB-525334下調肝星狀細胞miR-29b、miR-19b的表達

將對照組的miR-19b表達量設為1，TGF-β1干預組、SB-525334干預組、TGF-β1和SB-525334共干預組LX-2細胞miR-19b相對表達量分別為0.62±0.07、0.28±0.06、0.64±0.20，各干預組LX-2細胞miR-19b相對表達量較對照組明顯下降(P<0.01)，TGF-β1和SB-525334共干預組LX-2細胞miR-19b的相對表達量較SB-525334組高(P<0.05)，TGF-β1和SB-525334共干預組與TGF-β1干預組LX-2細胞 miR-19b的相對表達量比較無明顯差異(P>0.05)。

將對照組的miR-29b表達量設為1，TGF-β1干預組、SB-525334干預組、以及TGF-β1和SB-525334共干預組LX-2細胞miR-29b相對表達量分別為0.77±0.05、0.44±0.04、0.61±0.06，各干預組LX-2細胞miR-29b相對表達量較對照組下降(P<0.05)，TGF-β1和SB-525334共干預組LX-2細胞 miR-29b 的相對表達量較TGF-β1干預組低(P<0.05)，TGF-β1和SB-525334共干預組LX-2細胞miR-29b的相對表達量較SB-525334干預組高(P<0.05)。

討 論

急慢性肝臟損傷時，HSC活化、增殖，轉變為肌成纖維樣細胞，并分泌大量的α-SMA和細胞外基質蛋白，包括纖連蛋白和Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原并具有收縮功能，從而導致纖維化的發生[5-7]。TGF-β1是HSC增殖強有力的刺激因子，本實驗中也發現TGF-β1可以明顯促進細胞增殖，給予TGF-β1抑制劑SB-525334后HSC數目減少，增殖明顯受到抑制。SB-525334是一種強效小分子抑制劑，選擇性抑制TGF-β1受體，本研究中發現SB-525334隨著濃度升高對細胞生長抑制作用更加明顯，當其濃度達到一定量后抑制作用稍有下降，因此SB-525334對HSC生長主要起抑制作用。

肝臟庫普弗細胞刺激HSC活化時產生大量的TGF-β1[8]。肝纖維化時TGF-β1持續增加，激活Smad和MAPK信號通路，導致HSC分泌大量I型膠原。SB-525334是ALK5(TGF-β1 I型受體)的抑制劑，在腎臟RPTE細胞中可抑制Smad2/3的轉位抑制腎臟纖維化發生[9]。本研究中，單獨給予TGF-β1刺激的HSC的I型膠原蛋白表達明顯升高，與之前研究相符。之后，再給予TGF-β1的抑制劑SB-525334干預后，HSC的I型膠原蛋白表達則明顯降低，這表明SB-525334可通過抑制TGF-β1信號通路，抑制HSC細胞外基質的產生，進而發揮抑制肝纖維化的作用。

研究表明，miR-19b在肝纖維化進程中起重要作用。Lakner等[2]研究發現，miR-19b在活化的HSC中表達明顯下降，miR-19b過表達通過抑制其靶基因 TGF-βRII ，而阻斷 TGF-β信號通路，最終抑制I型膠原和α-SMA 表達。Sekiya等[10]研究發現，轉染miR-29b前體可明顯減輕I型膠原和II型膠原mRNA的表達，并且明顯削弱HSC活化的基因如α-SMA、DDR2、FN1和PDGFR-β的表達。過表達miR-29b可使HSC處于靜止狀態，使膠原表達降低并抑制細胞增殖。在本研究中，miR-19b和miR-29b在TGF-β1刺激LX-2細胞后表達明顯減少，與之前研究相符。本研究發現，SB-525334干預后的HSC miR-19b和miR-29b表達下降，與對腎纖維化的研究結果不符[4]。研究表明HSC中miR-29的表達下調是由PDGF-BB、TGF-β和炎癥信號通路如LPS和NF-κB信號通路共同調節[4]。在本實驗中SB-525334抑制TGF-β1信號通路的同時，可能反應性引起NF-κB信號通路激活，導致miR-19b和miR-29b表達下調，并抑制I型膠原的表達。

綜上所述，SB-525334可抑制HSC I型膠原的分泌，并下調miR-29b、miR-19b的表達。SB-525334作為TGF-β1新的小分子抑制劑，其作用機制仍需進一步研究，在不同細胞，不同的藥物濃度和作用時間，可能會影響藥物作用的發揮，從而對不同基因的表達產生不同的影響。