去睪丸老年大鼠血管鈣化程度與骨代謝水平研究

楊娜 周進平 林曉容

摘要：目的? 觀察去睪丸老年大鼠血管鈣化程度、骨密度（BMD）及骨代謝指標[Ⅰ型前膠原N-端前肽（PⅠNP）、骨鈣素（BGP）和Ⅰ型膠原交聯羧基末端肽（CTX-Ⅰ）]的變化。方法? 取7月齡雄性SD大鼠16只，隨機分造模組及對照組。造模組采用雙側睪丸摘除法建立大鼠骨質疏松模型，對照組進行假手術。術后6個月，處死所有大鼠，取右側股骨以雙能X線吸收儀測量BMD，并取胸主動脈用茜素紅染色觀察鈣化情況，用酶聯免疫吸附法測量血清PⅠNP、BGP和CTX-Ⅰ濃度。結果? 造模組BMD低于對照組[（0.2636±0.0096）g/cm2 vs （0.3104±0.0157）g/cm2]，差異有統計學意義（P<0.05）;造模組胸主動脈鈣化明顯，血清P1NP、BGP含量較對照組降低差異有統計學意義（P<0.05），而血清CTX-Ⅰ高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論? 通過去勢法可建立老年大鼠骨質疏松模型，且骨質疏松形成過程中血管鈣化程度明顯增加，骨形成標志物降低，骨吸收標志物增高。

關鍵詞：去睪丸大鼠;老年性骨質疏松;血管鈣化;骨代謝

中圖分類號：R322.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.04.002

文章編號：1006-1959（2019）04-0005-03

Abstract：Objective? To observevascular calcification， bone mineral density （BMD） and bone metabolism markers in testicular aged rats [type I procollagen N-terminal propeptide （PⅠNP）， osteocalcin （BGP） and type I collagen cross-linked carboxy terminal peptide （CTX） -Ⅰ）] changes. Methods 16 male Sprague-Dawley rats aged 7 months were randomly divided into two groups. In the model group， the rat osteoporosis model was established by bilateral testicular extraction， and the control group was given sham operation. Six months after operation， all rats were sacrificed. BMD was measured by dual-energy X-ray absorptiometry. The thoracic aorta was stained with alizarin red to observe calcification. Serum P1NP and BGP were measured by enzyme-linked immunosorbent assay and CTX-Ⅰ concentration. Results? The BMD of the model group was lower than that of the control group [（0.2636±0.0096） g/cm2 vs （0.3104±0.0157） g/cm2]， the difference was statistically significant （P<0.05）; The calcification of the thoracic aorta was obvious， and the serum PⅠNP and BGP levels were significantly lower than those of the control group （P<0.05）， while the serum CTX-Ⅰ was higher than the control group， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion? Osteoporosis model can be established in the aged rats by castration method， and the degree of vascular calcification is significantly increased during the process of osteoporosis formation， bone formation markers are decreased， and bone resorption markers are increased.

Key words：Testicular rats;Senile osteoporosis;Vascular calcification;Bone metabolism

老年性骨質疏松和血管鈣化均為衰老伴行的高發疾病，在老齡化社會尤為需要引起重視。臨床觀察發現二者存在一定的相關性，近年來大量的基礎及臨床研究也證實了這一點[1，2]。這無疑為同步防治骨質疏松和血管鈣化帶來了佳音。為了更好地研究二者相關性需要建立更符合發病機制、病理變化的動物模型。在目前的研究當中，多以建立血管鈣化模型或SAMP6快速老化骨質疏松模型來研究兩者相關性。本研究則通過雙側睪丸切除術建立老年性骨質疏松大鼠模型，觀察老年性骨質疏松大鼠血管鈣化情況及骨代謝變化，旨在為老年性骨質疏松和血管鈣化相關性的基礎研究提供參考依據。

1材料與方法

1.1儀器與試劑? DEXA（Hologic公司）;茜素紅S（Sigma公司）;大鼠血清P1NP、BGP和CTX-Ⅰ的ELISA檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.2實驗動物與分組? 選取7月齡SPF級雄性SD大鼠16只，體重500～650 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。適應性飼養1周后，隨機分為造模組及對照組，每組8只。

1.3實驗方法

1.3.1骨質疏松模型建立? 術前12 h禁食禁水，使用2%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，深度麻醉后固定、脫毛、消毒，嚴格遵守無菌原則。在陰囊部位作1 cm切口切開陰囊皮膚，分離睪丸及附睪，結扎后切除睪丸，止血，逐層縫合。術后給予抗感染治療。造模組行雙側睪丸切除術，對照組僅切除睪丸周圍部分脂肪組織。

1.3.2 BMD檢測? 術后6個月將所有大鼠用2%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉后腹主動脈采血處死，取右側完整股骨標本，將所附著的肌肉和軟組織剔除干凈。采用DEXA測定股骨BMD。

1.3.3茜素紅S染色觀察鈣化情況? 選取胸主動脈標本節段，用生理鹽水反復沖洗，福爾馬林固定24 h，常規石蠟包埋切片，經二甲苯脫蠟和各級乙醇水洗，2%茜素紅染色5 min，封片，鏡下觀察鈣化情況。

1.3.4血清PⅠNP、BGP和CTX-Ⅰ的ELISA檢測? 腹主動脈取血，3000 r/min離心10 min，分離血清后-20℃保存待測。所有指標的檢測均根據ELISA試劑盒說明書要求進行，用酶標儀（波長450 nm）測定樣本吸光度，根據標準曲線計算含量。

1.4統計學方法? 實驗數據用SPSS18.0軟件進行統計學分析，計量資料以（x±s）表示，符合正態分布、方差齊的數據比較采用t檢驗，若數據為非正態分布或方差不齊，則采用非參數秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義，P<0.01為差異統計學意義顯著。

2結果

2.1兩組大鼠股骨BMD比較? 造模組大鼠股骨BMD為（0.2636±0.0096）g/cm2，低于對照組的（0.3104±0.0157）g/cm2，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.2兩組大鼠胸主動脈鈣化情況? 茜素紅S染色結果顯示：對照組胸主動脈各層結構完整，均未見明顯的鈣化，造模組胸主動脈可見大量散在桔紅色鈣化沉積。與對照相比，造模組胸主動脈鈣化明顯增加。見圖1。

2.3兩組大鼠血清PⅠNP、BGP和CTX-Ⅰ水平比較? 造模組血清中P1NP和BGP水平低于對照組，CTX-Ⅰ水平高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。

3討論

流行病學調查表明，全球50歲以上的人口中約有1/3的女性和1/5的男性被不同程度的骨質疏松所困擾[3]，其較高的致殘率給患者和社會帶來一定的健康和經濟負擔。骨質疏松包括原發性骨質疏松和繼發性骨質疏松，其中原發性骨質疏松又分為老年性骨質疏松和絕經后骨質疏松。目前大部分研究針對絕經后骨質疏松，而本研究選取7月齡雄性大鼠，通過雙側睪丸切除術建立老年性骨質疏松大鼠模型并飼養了6個月。模擬了隨年齡增長，性激素水平逐漸下降、機體功能衰退，導致以骨形成減少為主的骨代謝失衡過程。不同于采用去卵巢建立雌激素下降引起骨吸收增加的絕經后骨質疏松。本研究結果顯示，造模組BMD較對照組明顯下降，提示高齡大鼠切除睪丸后，可成功復制出骨質疏松模型。

老年性骨質疏松是與衰老伴行的骨丟失，由于機體功能衰退，骨髓基質細胞向成骨細胞轉化受阻，成骨細胞減少而破骨細胞功能正常[4]。BMD是國際公認用來診斷骨質疏松并觀察療效的金標準，但存在局限性。而骨代謝標志物能不依賴于BMD，優先初步反映治療效果及骨折風險。包括骨形成標志物PⅠNP和BGP，和骨吸收標志物CTX-Ⅰ等。骨形成標志物PⅠNP和BGP隨年齡增長而降低，是臨床常用反映骨形成的生化指標，具有較高的敏感性和特異性[5]。本研究中，大鼠血清PⅠNP和BGP水平均降低，而骨吸收標志物CTX-Ⅰ水平升高。證明了老年人由于骨細胞轉換率下降，成骨細胞分泌減少、活性降低，骨形成減少，導致血清中骨形成標志物降低，而破骨細胞功能正常。這與國內外實驗研究相符合，也與臨床上老年性骨質疏松所表現的骨形成標志物降低相一致[6]。

大量臨床研究表明，老年性骨質疏松和血管鈣化的發生率呈正相關[7，8]，二者在危險因素、發病機制和臨床治療等方面也存在一定的聯系[9，10]。越來越多研究顯示，血管鈣化是血管平滑肌細胞表型向成骨樣細胞表型轉化且可預防可逆轉的主動調節過程，并伴隨有礦化合成調節蛋白（如骨鈣蛋白、骨橋蛋白等）的增多，與成骨的礦化過程相似[11]。同時，骨組織中流失的鈣鹽沉積于血管壁上則形成鈣化，在鈣化的血管中也發現了許多骨相關細胞蛋白因子（如骨保護素、骨鈣素、γ-羧基谷氨酸基質蛋白等）[12-14]。

若在此過程中，發現某種關聯的共同致病因子并從中阻斷，可提前識別個體發生疾病的風險并預防診治，對進一步揭示二者的共同發病機制對危害老年健康的兩大公共問題的處置具有重大意義。本實驗初步提示了，摘除睪丸的高齡大鼠在形成骨質疏松的同時也產生了血管鈣化，為研究老年性骨質疏松和血管鈣化相關性提供一定的模型研究基礎。但二者之間關系復雜多樣，其確切機制還有待進一步深入研究。

綜上所述，通過雙側睪丸切除術建立老年性骨質疏松大鼠模型，不僅BMD降低，而且出現明顯的血管鈣化，并伴有血清PⅠNP和BGP水平降低的現象。進一步提示了骨形成標志物PⅠNP和BGP可能在老年性骨質疏松和血管鈣化的共同機制中發揮重要作用。有研究也發現了PⅠNP和BGP與血管鈣化存在一定關聯[15，16]，但具體機制需進一步探索。

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收稿日期：2018-12-3;修回日期：2018-12-13

編輯/成森