表達視網膜Müller細胞的轉基因小鼠基因鑒定△

姚曉倩 方媛 吳繼紅 李倩 牛亮亮 孫興懷 陳君毅

(復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院眼科 上海 200031)

Müller細胞為脊椎動物視網膜最主要的膠質細胞，它幾乎貫穿整個視網膜，在解剖結構及功能上，與視網膜各層神經元胞體和突觸間有著廣泛的聯系[1-2]。Müller細胞為視網膜神經細胞再生的主要來源。有研究[3-5]表明，哺乳動物視網膜受損后，其Müller細胞在生長因子或轉錄因子作用下，可以迅速進入細胞周期，去分化為多潛能的視網膜前體細胞，并進一步分化為視網膜神經細胞。因此，視網膜Müller細胞被認為是眼內一種潛在的視網膜干細胞。CRALBP (cellular retinaldehyde-binding protein)及谷氨酰胺合酶(glutamine synthetase，GS)為標染視網膜Müller細胞的標記物，但是視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelial, RPE)也可被CRALBP及GS標染[6]，所以，為保證增殖細胞為視網膜Müller細胞來源，我們選擇應用轉基因模型。目前，轉基因模型在多個領域中發揮了不可估量的作用，包括通過熒光蛋白表達標記特定神經元、敲除或過度表達特定細胞類型的基因以及削弱或抑制特定神經元群體的活性。例如，使用轉基因小鼠，在已定義的神經元群中表達相對高水平的熒光標記物，如Thy1-EYFP[7]。

目前研究發現，通過與不同細胞類型特異性Cre系雜交，可以檢測標記細胞的形態，追蹤軸突投射，記錄電生理活動，進行短期和長期的體內成像[8-9]，并跟蹤發育和分化[10]。新的Cre報告小鼠已存入JAX小鼠庫供分發(JAX小鼠庫存編號: Ai2,007920; Ai3,007903; Ai6,007906; Ai9,007909; Ai14,007914)，且到目前為止，最常用產生Cre 報告小鼠的位點是Gt(ROSA)26Sor (Rosa26)位點[11]，因為Rosa26是一個通用的表達位點，并且允許一個外源性強啟動子插入其中以驅動更高層次的表達。Rosa26位點通過靶向插入含有強表達CAG啟動子的構建物對其進行修飾，隨后插入loxP側(floxed)停止盒控制的熒光標記基因[7]。所以，我們從美國Jackson實驗室引進了2種轉基因小鼠：Sox2-Cre和Rosa26轉基因小鼠，此2種轉基因鼠的后代可使視網膜Müller細胞都表達特異熒光。若增殖細胞的熒光可以和其共染，則可確定增殖細胞為Müller細胞來源，即可以追蹤到所有的新增殖細胞，進而研究其分化。我們將通過基因鑒定、免疫熒光實驗方法選擇出可特異性表達視網膜Müller細胞的后代。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 從美國Jackson實驗室引進Sox2-Cre和Rosa26轉基因小鼠。飼養動物房室溫為20～26 ℃，濕度為40%～70%，光照12 h明暗交替。

1)Sox2-Cre轉基因鼠。庫存編號：008454。品系名稱：B6.Cg-Tg(Sox2-cre)1Amc/J[12]。

Sox2-Cre轉基因鼠是一種正常體型、可繁育的健康小鼠，這些轉基因小鼠在含有基因2啟動子SRY(sex determining region-Y)-box小鼠的控制下表達Cre重組酶。當Sox2-Cre轉基因與含有loxP側序列的小鼠交配時，Cre 重組酶的參與使后代表達Sox2組織的floxed序列缺失，且來源于雜合子轉基因雌性鼠的后代均可有Cre重組酶的活動，與其表型無關。這種母系遺傳的方式可以提供有效、高速繁育動物的作用機制。

Sox2-Cre轉基因由來源于Sox2(包含基因-2的SRY-box)小鼠12.5 kb的上游調節區域、雞 β-actin 內含子、一個Cre重組酶基因及兔 β-球蛋白 poly A序列組成。這種轉基因被引入B6CBAF1供體卵子中，此品系最初與C57BL/6交配，后代再與Swiss Webster小鼠交配，最終再與C57BL/6交配，直到繁育到第11代。

2)Rosa 26轉基因鼠。庫存編號：007914。品系名稱：B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J[13]。

Ai 14 Cre報告基因小鼠攜帶有Gt(ROSA)26Sor位點的靶向突變，該突變帶有一個loxP停止盒，以阻止CAG啟動子驅動的紅色熒光蛋白變異(tdTomato)的轉錄。tdTomato是通過Cre介導的重組表達的。

Ai14半合子小鼠對這種Rosa-CAG-LSL-tdTomato-WPRE::deltaNeo條件等位基因是可行的和可育的。一個loxP側面的停止盒防止下游紅色熒光蛋白變異株(tdTomato)的轉錄。當與表達Cre重組酶的小鼠交配后，所產生的后代在Cre重組酶表達組織中可以刪除停止盒，從而促使tdTomato的表達。因為這個CAG啟動子驅動的報告結構是有針對性的插入Gt(ROSA)26Sor位點，所以tdTomato的表達由表達Cre重組酶的組織決定。Ai14小鼠在引入Cre重組酶前不會表達tdTomato，引入Cre重組酶后其可以表達tdTomato，并且暴露于Cre后的tdTomato表達有望通過免疫熒光和mRNA檢測出。這些Ai14小鼠可用作Cre報告株，經Cre介導重組后表達紅色熒光蛋白變異株tdTomato。

1.2 耗材 1.5 mL EP管、載玻片、蓋玻片、水浴鍋(Pony Science)、高速冷凍離心機 (Thermo Scientific)、聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增儀(Eppendorf Mastercycler)、移液槍(Eppendorf)、移液槍頭、電泳儀(Bio Rad PowerPac)、凝膠成像儀(JS-6800)、冷凍切片機(Leica CM3050 S)、共聚焦顯微鏡(Leica SP8)。

1.3 試劑 DNA裂解液[DirectPCR (Tail) Lysis Reagent；VIGEN Biotech Inc]、蛋白酶K (Proteinase K)、DNA mix(Takara Code No.R040Q/R040A)、ddH2O、瓊脂糖(上海威奧生物科技有限公司)、電泳緩沖液(碧云天)、溴化乙啶、DNA上樣緩沖液(TianGen Biotech)、DNA marker(TianGen Biotech)。

封閉液：5%BSA(Shanghai Yeasen Biotechnology)+0.3%Triton X-10(Sigma, T9284)+PBS；稀釋液：1%BSA(Shanghai Yeasen Biotechnology)+0.3%Triton X-10(Sigma, T9284)+PBS；一抗：rabbit anti-GS(1∶1 000, Abcam, Boston, MA)；二抗：Alexa FluorTM 488 goat anti-rabbit (1∶200, Invitrogen)；Hoechst 33258 pentahydrate (1∶1 000; Life Technology, Eugene, OR, USA)；抗熒光衰退封片劑(上海威奧生物科技有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 鑒定原理 通過電穿孔(129S6/Sv Ev Tac x C57 BL/6)F1衍生的胚胎干細胞將靶向載體插入Gt(Rosa)26Sor位點的外顯子1和2之間。Rosa-CAG-LSL-tdTomato-WPRE靶向載體5′～ 3′端由CMV-IE增強子/雞-肌動蛋白/兔-球蛋白的混合啟動子 (CAG)，一個FRT站點，一個loxP側的停止盒(所有3個讀幀中都有停止密碼子和一個三poly A信號)，tdTomato序列 [12個殘基與2個拷貝的蛋白(串聯二聚體)連接融合的非齊聚Ds紅色熒光蛋白變異序列]，土撥鼠肝炎病毒后轉錄調節元素(WPRE-提高mRNA轉錄的穩定性)，一個 poly A信號和一個attB/ attp側的PGK-FRT-Neo-poly A盒組成。我們所選用的Ai 14 Cre報告基因小鼠攜帶有Gt(ROSA)26Sor位點的靶向突變，該突變帶有一個loxP停止盒，以阻止CAG啟動子驅動的紅色熒光蛋白變異(tdTomato)的轉錄。當與表達Cre重組酶的小鼠交配后，所產生的后代在Cre重組酶表達的組織中可以刪除停止盒，從而促使tdTomato的表達[12-14](圖1)。

1.4.2 鑒定方法 剪除剛出生的以上2種轉基因小鼠后代的鼠尾2 mm，將鼠尾放入1.5 mL的EP管中，做好標記，加入DNA裂解液(200 μL)+蛋白酶K(4 μL), 放入55 ℃水浴鍋孵育過夜。第2天，水浴鍋調至85 ℃繼續加熱45 min，然后放置于高速冷凍離心機，2 000轉/min離心2 min。選用DNA mix 10 μL、引物(表1)各0.4 μL，樣本1 μL，ddH2O 7.4 μL配置20 μL體系。將配好的體系放入PCR擴增儀，設定基因鑒定所需的循環(表2)行定量PCR。野生型片段約324 bp，因Cre重組酶的引入，刪除含loxP位點片段后的片段為250 bp。

圖1. tdTomato轉基因小鼠鑒定原理示意圖

表1 PCR引物序列

表2 PCR程序

注“-”示無此項

1.4.3 冷凍切片及免疫熒光 通過基因鑒定出的轉基因小鼠處死后取其眼球，小鼠眼球的固定、脫水、包埋及制作冷凍切片同我們之前的實驗方法[15]。選取冷凍切片行免疫熒光，首先室溫下冷凍切片應用封閉液封閉1 h，一抗選用Müller細胞的標記物rabbit anti-GS，用稀釋液按1∶1 000比例稀釋一抗，4 ℃一抗孵育過夜。第2天，切片用PBS清洗4遍(約20 min),孵育二抗，二抗為Alexa FluorTM 488 goat anti-rabbit，用稀釋液按 1∶200 稀釋二抗，室溫孵育2 h，PBS再次清洗4遍后標染細胞核的標記物-Hoechst 33258 pentahydrate，按1∶1 000稀釋，標染5 min，清洗4遍，應用抗熒光衰退封片劑封片，共聚焦顯微鏡掃描圖像。

2 結果

2.1 鼠尾DNA的基因型鑒定結果 如果只能擴增到324 bp條帶，說明小鼠是野生型；若能得到250 bp和324 bp 2個條帶，說明是雜合子小鼠(圖 2)。

圖2. tdTomato轉基因小鼠基因型鑒定結果

2.2 tdTomato轉基因小鼠可表達視網膜Müller細胞標記物GS 轉基因小鼠視網膜Müller細胞本身自發紅色熒光(tdTomato：其在細胞突觸及胞體均可檢測出)，用GS標記視網膜Müller細胞表達綠色熒光，發現轉基因小鼠的紅色熒光可以和GS綠色熒光共標染，進一步確定轉基因小鼠可表達視網膜Müller細胞(圖 3)。

圖3. tdTomato與GS共同標染視網膜Müller細胞

3 討論

轉基因動物是指將外源基因用實驗方法插入動物生殖細胞的基因組而獲得插入基因的特性，并能正常繁衍的動物[16]。隨著人類基因組DNA測序完成，特異基因的功能鑒定已成為人類基因組學的首要任務[17]。目前，轉基因動物在基因調控機制、致癌作用及神經系統反應等探討中發揮重要作用[18-22]。因此，在我們的實驗中，成功引進Sox2-Cre以及Rosa26轉基因小鼠為今后實驗確定增殖細胞為視網膜Müller細胞來源提供了可靠的依據。此2種小鼠的雜交后代可以使tdTomato基因表達，且Ai14 Cre報告基因半合子小鼠的穩定性較強，其可以使視網膜Müller細胞的形態在共聚焦顯微鏡下給人以直觀的展示，Müller細胞突觸和胞體同時表達特異紅色熒光[7]。但是，由于轉基因小鼠常采用同系基因小鼠作為正常對照，轉基因小鼠和與之相對應的正常小鼠從外觀上很難區分，因此，轉基因小鼠基因型的鑒定為后續功能實驗開始的首要任務[17]。

本實驗采用傳統DNA提取、PCR擴增及電泳等方法成功鑒定出可特異表達tdTomato基因的轉基因小鼠后代，并通過免疫熒光方法進一步證明表達tdTomato特異熒光的細胞為Müller細胞。轉基因小鼠模型的成功構建及鑒定提高了我們今后實驗結果的準確性，也為致盲性眼病的研究提供了重要依據。

志謝與聲明：此項實驗由我們實驗人員獨立完成，同時感謝動物房辛勤付出的老師和工作人員。所有動物實驗步驟均遵循動物管理委員會規則，并嚴格遵循動物在眼科及視力研究中的有關聲明。