基于TLR4/NF-κB信號通路探討醒腦靜改善反復缺血-再灌注腦損傷小鼠學習記憶能力的作用研究

廖衛寧　楊麗　張合　董文理

【摘要】 目的：探討醒腦靜通過TLR4/NF-κB信號通路改善反復缺血-再灌注（I/R）腦損傷小鼠學習記憶能力的作用。方法：將50只雄性C57BL/6小鼠隨機分為假手術組、模型組，醒腦靜低、中、高劑量組，制備大鼠腦反復I/R損傷模型。造模成功2 h后，醒腦靜低、中、高劑量組分別給予醒腦靜注射液1、5、10 mL/kg進行腹腔注射，1次/d，連續給藥7 d。假手術組和模型組腹腔給予等容量生理鹽水。用Morris水迷宮實驗檢測小鼠的學習記憶能力，對腦組織進行TTC染色，檢測腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、TLR4、NF-κB和IκBα表達。結果：與假手術組相比，模型組小鼠逃避潛伏期的時間和腦梗死體積均顯著升高，腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、TLR4、NF-κB和IκBα表達均顯著升高，穿越平臺次數顯著降低（P<0.05）;與模型組相比，各醒腦靜治療組小鼠逃避潛伏期的時間和腦梗死體積均顯著降低，腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、TLR4、NF-κB和IκBα表達均顯著降低，穿越平臺次數顯著增加（P<0.05），且隨藥物劑量增大而變化（P<0.05）。結論：醒腦靜能減小腦梗死體積，改善反復腦I/R損傷小鼠學習記憶能力，其機制可能與抑制腦組織中TLR4/NF-κB信號通路，減輕炎癥刺激有關。

【關鍵詞】 醒腦靜; TLR4/NF-κB信號通路; 反復缺血-再灌注腦損傷; 學習記憶能力

Effect of Xingnaojing on Learning and Memory in Mice with Repeated Ischemia-reperfusion Brain Injury Based on TLR4/NF-κB Signaling Pathway/LIAO Weining，YANG Li，ZHANG He，et al.//Medical Innovation of China，2019，16（21）：030-034

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Xingnaojing on learning and memory in mice with repeated ischemia-reperfusion brain injury based on TLR4/NF-κB signaling pathway.Method：Fifty male C57BL/6 mice were randomly divided into sham-operated group and model group，and Xingnaojing low，medium and high dose groups.The brain repeated I/R injury model were established.Two hours after the successful establishment of the model，Xingnaojing low，medium and high dose groups were given intraperitoneal injection of 1，5 and 10 mL/kg respectively，once a day for 7 days.The sham-operated group and model group were given intraperitoneal saline of equal volume.Morris water maze test was used to detect the learning and memory ability of mice.TTC staining was used to detect the expression of TNF-α，IL-1β，IL-6，TLR4，NF-κB and IκBα in brain tissue.Result：Compared with the sham-operated group，the time of escape latency and the volume of cerebral infarction in the model group were significantly increased，and the expressions of TNF-α，IL-1β，IL-6，TLR4，NF-κB and IκBα in brain tissue were significantly increased，and the times of crossing the platform were significantly decreased（P<0.05）.Compared with the model group，the time of escape latency and the volume of cerebral infarction in the Xingnaojing treatment group were significantly decreased，and the expressions of TNF-α，IL-1β and IL-6 in brain tissue were significantly decreased，and the expression of TLR4，NF-κB and IκBα decreased significantly，and the number of times crossing the platform increased significantly（P<0.05），and changed with the increase of drug dosage（P<0.05）.Conclusion：Xingnaojing can reduce the volume of cerebral infarction and improve the learning and memory ability of mice with repeated brain I/R injury.Its mechanism may be related to inhibiting TLR4/NF-κB signaling pathway in brain tissue and alleviating inflammatory stimulation.

【Key words】 Xingnaojing; TLR4/NF-κB signaling pathway; Repeated cerebral ischemia-reperfusion injury; Learning and memory ability

First-authors address：Xianning Central Hospital，the First Affiliated Hospital of Hubei University of Science and Technology，Xianning 437100，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.21.008

缺血性腦卒中是全球成年人死亡和殘疾的主要原因[1]。組織纖溶酶原激活劑（t-PA）靜脈溶栓治療缺血性腦卒中目前已獲批準，但會引起腦缺血/再灌注（I/R）損傷等繼發性損傷[2]。所以，預防腦I/R損傷對缺血性腦卒中的治療具有重要意義。免疫介導在腦I/R損傷中的作用日益被關注[3]。Toll樣受體（TLRs）在炎癥反應誘導中的重要作用已被證實，Toll樣受體4（TLR4）在腦I/R后被發現具有高度的誘導作用，可誘導激活多個激酶和核轉錄因子κB（NF-κB）[4]。有研究顯示，TLR4/NF-κB信號通路參與腦I/R損傷的損傷性炎癥過程，抑制TLR4/NF-kB信號通路可下調炎癥反應，減輕腦損傷[5]。因此，TLR4/NF-kB信號通路可能是腦I/R損傷的治療靶點。目前，許多研究集中在探索抗炎和神經保護因子，可能減輕腦I/R損傷。醒腦靜由麝香、冰片等提取精制而成的傳統中藥，對各種病因引起的意識障礙以及高熱等具有顯著療效，可通過降低腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）等促炎細胞因子的產生，抑制炎癥細胞浸潤，但醒腦靜對意識障礙的治療作用的機制尚不清楚[6-7]。因此，考慮到醒腦靜在炎性疾病和意識障礙中的作用，本研究假設醒腦靜通過下調TLR4/NF-κB信號通路來保護腦I/R損傷，探索醒腦靜在腦I/R損傷中的潛在作用及其機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取雄性6周齡C57BL/6小鼠50只，體重18～24 g，由河北醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（冀）2012-0002。在SPF環境中自由進食和飲水，控制飼養環境晝夜循環（12 h/12 h），適應性喂養一周后進行實驗。動物相關處置均符合《中華人民共和國實驗動物管理條例》要求。

1.2 主要試劑與儀器 醒腦靜注射液（生產廠家：無錫濟民可信山禾藥業有限公司，批準文號：Z32020563）;三苯基四氮唑（TTC）（生產廠家：美國Biosharp公司，注冊證號：EZ1609A129）;3%戊巴比妥（生產廠家：上海上藥新亞藥業有限公司，批準文號：H31020532）;肌酸磷化脢-同工脢MB（CK-MB）和乳酸脫氫酶（LDH）[生產廠家：中生北控生物科技有限公司，批準文號：京藥監械（準）字2010第2400837號和第2400838號];TNF-α、IL-1β和IL-6酶聯免疫吸附試劑盒（生產廠家：京美生物科技有限公司）;BCA蛋白測定試劑盒和Western Blot試劑盒（生產廠家：上海碧云天生物技術有限公司）;蛋白抽提試劑盒（生產廠家：武漢博士德生物工程有限公司）;TLR4、NF-κB和IκBα（生產廠家：美國Santa Cruz公司）;鼠抗β-actin單克隆抗體和辣根過氧化物酶HRP標記親和純化山羊抗鼠IgG二抗（生產廠家：北京中杉金橋生物技術有限公司）;Morris水迷宮裝置及DigBehv動物行為分析系統（生產廠家：上海吉量軟件科技有限公司，中國）;HBS-1096B酶標儀（生產廠家：南京德鐵實驗設備有限公司）;凝膠成像儀（生產廠家：美國UVP公司）;BIO-RAD垂直電泳儀（生產廠家：美國BIO-RAD公司）。

1.3 分組與造模 根據隨機數字表法將小鼠均分為假手術組，模型組，醒腦靜低、中、高劑量組。每組用5只大鼠進行水迷宮實驗和TTC染色、5只進行腦蛋白測定。制備大鼠腦反復I/R損傷模型：大鼠禁食12 h后用3%戊巴比妥（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后，分離左側頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈，用無損動脈夾夾閉左側頸總動脈20 min，松開動脈夾10 min后再關閉，反復3次，最后去除動脈夾，恢復血液供應，用生理鹽水清洗切口后逐層縫合，分籠飼養。假手術組只分離血管，不進行阻塞血流。造模成功2 h后，醒腦靜低、中、高劑量組分別給予醒腦靜注射液1、5、10 mL/kg進行腹腔注射，1次/d，連續給藥7 d。假手術組和模型組腹腔給予等容量生理鹽水。

1.4 Morris水迷宮實驗 術前第3天至手術前小鼠在Morris水迷宮內自由游泳以適應環境，術后第3天開始對大鼠進行水迷宮訓練，連續進行4 d。在停藥后進行水迷宮實驗。

1.5 TTC染色 做完Morris水迷宮實驗后處死小鼠，取完整腦組織，行冠狀位切片，厚度2 mm，置于2%的TTC染液中孵育30 min，用磷酸鹽緩沖液終止染色。用Image Pro Plus 6.0軟件計算梗死體積。

1.6 Elisa法檢測腦組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平 取適量損傷側腦組織，制成勻漿，吸取上清進行實驗。根據ELISA試劑盒說明書進行IL-1β和TNF-α含量測定，在450 nm處測各孔吸光度（A）值。

1.7 Western Blot法檢測腦組織中TLR4、NF-κB和IκBα的表達 取適量損傷側腦組織，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，用預冷的PIPA裂解液充分勻漿，冰浴2 h;離心取上清，-80 ℃保存。進行電泳、切膠;孵育一抗、孵育二抗，用凝膠成像系統采集圖像并進行分析。

1.8 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，采用單因素方差分析進行檢驗，組間比較用SNK-q檢驗。以P<0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 醒腦靜對反復腦I/R損傷小鼠學習記憶能力的影響 與假手術組相比，模型組小鼠逃避潛伏期時間顯著升高，穿越平臺次數顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05）;與模型組相比，各醒腦靜治療組小鼠逃避潛伏期的時間均顯著降低，穿越平臺次數顯著升高，且隨藥物劑量增大而變化，差異均有統計學意義（P<0.05）。與假手術組相比，模型組小鼠腦梗死體積顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）;與模型組相比，各醒腦靜治療組小鼠腦梗死體積顯著降低，且隨藥物劑量增大而降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1和圖1。

2.2 醒腦靜對反復腦I/R損傷小鼠腦組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響 與假手術組相比，模型組小鼠腦組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05）;與模型組相比，各劑量醒腦靜治療組小鼠腦組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著降低，且隨藥物劑量增大而降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 醒腦靜對反復腦I/R損傷小鼠腦組織中TLR4、NF-κB和IκBα表達的影響 與假手術組相比，模型組小鼠腦組織中TLR4、NF-κB和IκBα表達均顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05）;與模型組相比，各劑量醒腦靜治療組小鼠腦組織中TLR4、NF-κB和IκBα表達均顯著降低，且隨藥物劑量增大而降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表3和圖2。

3 討論

腦血管病是臨床常見病，腦缺血性卒中是最常見的。腦缺血性卒中的后果之一是腦缺血導致腦梗死，進而導致認知功能障礙和血管性癡呆，給患者及其家屬帶來巨大的經濟負擔和精神壓力[8]。選擇C57BL/6小鼠作為實驗動物，因為在小鼠品系中，C57BL/6小鼠最易發生腦缺血。它們的后交通動脈也發育不良，因此無法彌補額葉腦缺血，有助于建立反復腦I/R損傷模型[9]。Morris水迷宮主要檢測空間記憶能力，可以排除動物情緒改變的干擾，尤其對與海馬密切相關的認知功能高度敏感[10]。本研究結果表明，醒腦靜對小鼠大腦的學習記憶功能有神經保護作用。同時，經醒腦靜處理的小鼠腦梗死灶大小均有明顯改善。因此，醒腦靜可能是一種潛在的治療認知缺陷的有效藥物。

近年來，越來越多的證據表明，免疫介導機制在腦I/R繼發性腦損傷中發揮關鍵作用。免疫介導的機制成為一個新的前沿，腦I/R引起的腦損傷部分原因是腦缺血發作后短時間內炎癥繼發損傷[11]。因此，在設計改善腦I/R損傷結局的治療策略時需要更多的考慮，抑制炎癥反應已成為腦I/R損傷的治療靶點。

醒腦靜在炎性疾病和神經病理學中具有保護作用[12]。然而，醒腦靜對腦I/R損傷的神經保護作用尚不清楚，醒腦靜對炎癥信號通路的拮抗能力尚待確定。在腦I/R損傷后的炎癥反應中，膠質細胞被激活，外周免疫細胞浸潤大腦，分泌大量炎癥細胞因子，誘導神經細胞凋亡。TNF-α、IL-1β和IL-6是潛在的細胞炎性因子，在腦I/R進展過程中，TNF-α、IL-1β和IL-6的水平顯著增加[13]。本研究結果表明，醒腦靜顯著降低TNF-α、IL-1β和IL-6水平。因此，醒腦靜抑制腦I/R后炎癥反應。在接下來的研究中，繼續探索了其神經保護和抗炎作用的潛在機制。

TLRs的激活已被證實在炎癥反應的誘導中發揮重要作用，TLRs是一類跨膜模式識別受體，可被缺血損傷或應激細胞釋放的內源性損傷相關分子模式（DAMPs）激活[14]。TLR4是第一個被發現的哺乳動物TLRs。DAMPs可以激活鄰近小膠質細胞中的TLR4/NF-κB信號通路，誘導促炎細胞因子的釋放，導致神經細胞的變性和凋亡[15]。在腦I/R損傷中，TLR4表達增加，激活NF-κB，導致IκBα磷酸化[16]。近期研究也證明，TLR4缺乏癥小鼠腦I/R后TLR4低誘導，腦I/R損傷減輕[17]。炎癥的發生受到一系列基因的表達和調控，NF-κB是其中關鍵成員。在腦I/R損傷惡化后，NF-κB表達增加，導致生成大量的炎癥細胞因子并釋放[18]。本研究結果顯示，醒腦靜能抑制TLR4/NF-κB信號通路。

綜上所述，醒腦靜通過抑制腦組織中TLR4/NF-κB信號通路，能改善反復腦I/R損傷小鼠學習記憶能力。同時，醒腦靜調節炎癥反應參與了TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白表達，為進一步了解醒腦靜治療腦I/R損傷的機制提供了新的思路。

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（收稿日期：2019-05-08） （本文編輯：程旭然）