肺炎支原體實時熒光定量DNA檢測的臨床研究

肖宗浩

【摘要】 目的：分析肺炎支原體實時熒光定量DNA檢測的臨床研究。方法：將2017年8月-2018年2月本院收治的98例呼吸道感染患兒作為此次研究檢測對象，均行MP-DNA和肺炎支原體血清學抗體檢測，觀察兩種檢測方法的最終陽性檢出率與不同時間點的檢測情況，并觀察兩組患兒癥狀緩解時間、重癥病例發生情況、肺外并發癥、后遺癥、住院天數等情況。結果：本組98例呼吸道感染患兒中確診為MP感染者共36例，占比36.73%，其中MP-DNA陽性檢出35例，MP-IgM陽性檢出33例，兩種方法最終MP感染檢出率對比差異無統計學意義（P>0.05）;在所有MP感染患兒中，入院當日確診為MP感染者共29例，入院后1周確診者33例，入院后2周確診者36例，MP-DNA檢測在入院當日陽性檢出率明顯高于MP-IgM，差異有統計學意義（P<0.05），經不同方法檢測后并接受一段時間治療顯示MP-DNA檢測者癥狀緩解時間及住院天數均短于MP-IgM檢測，且MP-DNA檢測并接受治療者重癥病例、肺外并發癥及后遺癥發生率均少于MP-IgM者，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論：實時熒光定量DNA檢測對MP感染的早期診斷具有積極的意義，在臨床上可以早期干預，對預防重癥病例的發生及減少因MP感染引起的并發癥及后遺癥。

【關鍵詞】 呼吸道感染; 肺炎支原體; 感染; 血清學抗體; 實時熒光定量DNA

Clinical Study of MP-DNA Detection with Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction/XIAO Zonghao.//Medical Innovation of China，2019，16（06）：0-053

【Abstract】 Objective：To study the mycoplasma pneumoniae- deoxyribose nucleic acid（MP-DNA）detection with real-time quantitative polymerase chain reaction（real-time quantitative PCR）.Method：A total of 98 respiratory tract infection children treated in our hospital from August 2017 to February 2018 were selected.Children were tested by MP-DNA and MP-IgM.The positive detection rate and detection conditions at each time period as well as symptom relief time，incidence rate of severe illness，pulmonary complications and sequela and hospitalization days were estimated.Result：36 cases（36.73%）were proved as MP infection，the positive detection cases based on MP-DNA and MP-IgM were 35 cases and 33 cases，the MP infection rate based on two methods was not statistically different（P>0.05）.Among MP infection children，29 MP infection cases were proved upon admission to hospital，33 cases after 1 week of admission and 36 cases after 2 weeks of admission.Upon admission to hospital，the positive detection rate based on MP-DNA was statistically higher than that of

MP-IgM（P<0.05）.After treatment，the symptom relief time and hospitalization days based on MP-DNA were shorter than those of MP-IgM，the incidence rate of severe illness，pulmonary complications and sequela based on MP-DNA were statistically lower than those of MP-IgM（P<0.05）.Conclusion：The real-time quantitative PCR is of great importance to the early diagnosis of MP infection，can reduce the incidence rate of severe illness，pulmonary complications and sequela.

【Key words】 Respiratory tract infection; Mycoplasma pneumoniae; Infection; Serological antibody;Real-time quantitative PCR

First-authors address：Meizhou Maternal and Child Health Family Planning Service Center，Meizhou 514000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.06.013

肺炎支原體（MP）可引起人類上呼吸道和下呼吸道感染，亦是引起兒童呼吸系統感染的重要病原之一，MP屬于柔膜體綱原核生物，缺乏細胞壁，對細菌性肺炎治療中常用的靶點為細胞壁的抗生素（如青霉素、頭孢類等）無效[1]。除了引起兒童、成人呼吸系統感染外，許多研究表明肺炎支原體還與許多其他肺外病變有關[2]。MP感染后治療不及時、不徹底容易引起反復呼吸道感染和嚴重的并發癥，因此早期診斷尤為重要，可避免臨床上用藥不當而延誤病情或產生耐藥菌[3]。以往多采用MP培養和分離，但由于MP生長緩慢，一般培養法不能滿足臨床快速診斷的需求，熒光定量DNA檢測是目前國內外最常用的MP感染診斷方法，其具有高度的敏感性和特異性，在MP感染的早期診斷中起到非常重要的作用[4-5]。

此次研究對2017年8月-2018年2月本院兒科住院的98例呼吸道感染患兒進行MP實時熒光定量DNA檢測和MP血清學抗體檢測，觀察不同檢測方法的檢出情況及患兒預后治療情況。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 此次研究案例資料均來源于2017年8月-2018年2月本院兒科收治的呼吸道感染的患兒。納入標準：出現明顯的呼吸道感染癥狀;入選前未接受抗生素治療者;均為起病1周以內就醫的患兒;對所有受試者采取的醫療措施均取得受試者家屬知情同意。排除標準：合并其他肺部疾病或心肝腎等臟器功能不全者;精神或認知功能障礙，無法配合檢測治療者。最終98例患兒納入研究，其中男56例和女42例，年齡3個月～12歲，平均（5.51±2.50）歲，年齡分布：3個月～4歲52例，4～8歲26例，8歲以上20例。本研究經院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法 所有患者分別在入院當日、入院后1周及入院后2周抽取血標本常規送檢，用微型顆粒凝集法（日本富士Serodla-macoⅡ顆粒凝集試劑盒）檢測血清MP-IgM抗體，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。同時分別在這三個不同時間點定量取0.20 mL血清，按照實時熒光定量PCR試劑盒（由TaKaRa公司提供）提供的以下反應體系進行PCR：總體積25 μL（含有12.5 μL的1×SYBR Premix DimerEraser，0.2 μmol的特異引物，2 μL cDNA模板）。PCR反應條件如下：95 ℃ 30 s一個循環，95 ℃ 5 s和60 ℃ 31 s 40個循環。根據檢測已知濃度的倍比稀釋的純化肺炎支原DNA的PCR產物做出的標準曲線對肺炎支原體DNA的PCR產物進行定量。

1.2.2 治療方法 當MP-DNA檢測，將拷貝數≥1×103 copy/mL的陽性患兒考慮為MP感染;

MP-IgM檢測，將MP-IgM≥1︰160的陽性患兒考慮為MP感染。明確診斷后給予抗支原體治療，首先進行呼吸道隔離，休息，供給足量水分及營養。積極化痰止咳，及時清除鼻內分泌物，保持呼吸道通暢，必要時可霧化吸入。選用具有緩慢而持久作用的解熱鎮痛藥，如乙酰氨基酚。關于該病的抗菌治療：（1）臨床首選阿奇霉素，用量為10 mg/（kg·d），5 d為一療程。根據情況可以應用2～4個療程，甚至更長。阿奇霉素每日僅需1次用藥，使用天數較少，已成為治療首選[2]。但對于6個月以下的嬰兒，阿奇霉素的使用尤其是靜脈制劑的使用要慎重，最好使用口服阿奇霉素制劑[3]。（2）支原體肺炎至少住院正規治療2周后改為口服藥物治療，否則療程過短容易反復。目前治療肺炎支原體肺炎的主導藥物為新大環內酯類（阿奇霉素、克拉霉素）、四環素類（多西環素、米諾環素）和喹諾酮類（環丙沙星、氧氟沙星、莫西沙星）藥物?？垢腥局委煹寞煶掏ǔＰ枰掷m10～14 d，部分難治性病例的療程可延長至3周左右，但不宜將肺部陰影完全吸收作為停用抗菌藥物的指征。（3）在上述三類抗菌藥物中，氟喹諾酮類藥物一般情況下應避免用于18歲以下的未成年人;四環素類藥物可引起牙齒黃染及牙釉質發育不良，8歲以下的兒童亦不宜使用。

1.3 觀察指標 觀察兩種檢測方法最終MP陽性檢出率與不同時間點MP感染的檢測情況，即入院當日、入院后1周、入院后2周進行觀察，并觀察兩組患兒癥狀緩解時間、住院天數、重癥病例發生情況、肺外并發癥、后遺癥情況。

1.4 診斷標準 以雙份血清抗體低度呈4倍以上增長作為確診MP感染的金標準，并聯合臨床癥狀、胸片等，參照諸福棠《實用兒科學》第7版中難治性肺炎支原體肺炎的診斷標準進行確診[4]。

1.5 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗;計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種檢測方法最終檢出MP感染情況 本組98例呼吸道感染患兒中確診為MP感染者共36例，占比36.73%，其中MP-DNA陽性檢出35例，MP-IgM陽性檢出33例，兩種方法最終MP感染檢出率對比差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

2.2 不同時間點MP感染檢測情況比較 本組98例患兒，入院當日確診為MP感染者共29例，入院后1周確診者32例，入院后2周確診者35例，MP-DNA檢測在入院當日陽性檢出率明顯高于MP-IgM，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.3 兩種檢測方法治療后癥狀緩解時間、住院天數比較 經不同方法檢測后，兩組患兒接受一段時間治療顯示，MP-DNA檢測者癥狀緩解時間及住院天數均短于MP-IgM檢測，差異均有統計學意義（P<0.05），見表3。

2.4 兩種檢測方法治療者重癥病例、肺外并發癥以及后遺癥發生情況比較 MP-DNA檢測并接受治療者重癥病例、肺外并發癥以及后遺癥的發生率均少于MP-IgM者，差異有統計學意義（P<0.05），見表4。

3 討論

MP是兒童社區獲得性肺炎（CAP）的重要病原之一，肺炎支原體肺炎（MPP）占住院兒童CAP的10%～40%，是兒科醫師廣泛關注的臨床問題[6]。MP感染的臨床表現多種多樣，感染既可以發生在上、下呼吸道及肺臟，亦可累及肺外系統，MP感染的臨床癥狀不具有特征性，其疾病的嚴重程度可變度大，可能會危及生命或導致嚴重的后遺癥[7-8]。近年來，兒童MPP呈現不少新的特點，臨床上不斷有肺炎支原體的報道，使用了“重癥肺炎支原體肺炎（SMPP）”“難治性肺炎支原體肺炎（RMPP）”“大環內酯類耐藥肺炎支原體肺炎（MRMPP）”等名稱，顯然MP感染給臨床帶來了新的問題和難點，更帶來診治上的挑戰[9-10]。因此，對MP感染的早期診斷顯得尤為重要，早期干預對預防重癥及減少并發癥的發生起到積極的作用[11]。

目前臨床上MP的病原學檢測：MP的培養和分離、MP核酸擴增技術、MP血清學檢測。其中經典的MP培養和分離是對咽拭子、氣道吸出物、胸腔穿刺液和肺泡灌洗液進行MP的分離培養，是診斷最可靠的依據[12]。但MP培養條件苛刻，生長緩慢，因而缺乏早期診斷價值。MP血清學檢測是目前臨床診斷MP感染的主要手段[13]。血清學檢測主要檢測MP-IgM、MP-IgG。單次MP-IgM抗體滴度≥1︰160對MP近期感染或急性感染有診斷價值，恢復期和急性期MP-IgM或IgG抗體滴度呈4倍或4倍以上增高或減低時，亦可診斷為MP感染[14]。但血清學檢測結果受病程的影響，即使早期產生的IgM也需要在感染1周后才能被檢測到[15]。嬰幼兒由于免疫功能尚未發育完善、產生抗體的能力較低，可能出現假陰性或低滴度的抗體[16]。2009-2012年北京兒童醫院對呼吸道感染兒童使用MP實時熒光定量檢測病原進行流行病學的統計[17]，近年分子檢測技術廣泛應用于MP診斷領域，包括普通PCR、巢式PCR、RT-PCR等，其可快速檢測到體內微量MP-DNA，方法的敏感度、特異度好，且不受患者免疫功能的影響[18]。楊文青等[19]對742例兒科住院患兒收集標本進行MP-DNA的定量檢測得出，4歲及以上兒童易感染肺炎支原體，且隨著年齡增長感染率逐漸增高;支氣管灌洗液標本的MP-DNA陽性率較高;FQ-PCR法檢測MP-DNA用于肺炎支原體感染的診斷有一定價值;林超群等[20]亦在研究中說明實時熒光定量PCR法對肺炎支原體感染的診斷與治療后監測比肺炎支原體抗體血清學檢測更優。為進一步盡早精準診斷，及時給予精準治療，對本院98例呼吸道感染患兒分別行MP-DNA和肺炎支原體血清學抗體檢測，結果顯示：MP-DNA與MP-IgM兩種方法在MP感染陽性檢出率對比，差異無統計學意義（P>0.05），但MP-DNA檢測在患兒入院當日MP感染陽性檢出率明顯高于MP-IgM，差異有統計學意義（P<0.05），經不同方法檢測后并接受一段時間治療顯示Mp-DNA檢測者癥狀緩解時間及住院天數均短于MP-IgM檢測，且Mp-DNA檢測并接受治療者重癥病例、肺外并發癥以及后遺癥的發生率均少于MP-IgM者（P<0.05）?？梢妼崟r熒光定量能檢測出病原體的DNA和RNA，能反映MP在人體內的生存情況，其不受年齡、產生抗體的能力、病程長短及用藥等因素的影響，在MP感染早期的檢出率最高。

然而關于肺炎支原體如何進入血液循環的機制目前尚未完全明確，以下幾點是本研究尚未解決而需作進一步研究的：（1）相同的肺炎支原體感染患者中同時檢測痰液、咽拭子與血清中的肺炎支原體DNA定量，比較其檢測率的差異;（2）比較血清與全血中肺炎支原體DNA定量的差異;（3）擴大樣本含量，進行肺炎支原體抗體與肺炎支原體DNA定量在各個病程階段的對比研究。綜上所述，MP感染可損傷全身任何系統，也說明其疾病的嚴重程度可變度大，可能危及生命或導致嚴重的后遺癥。因此早期診斷、早期治療顯得尤為重要，實時熒光定量MP-DNA在MP感染早期的檢出率最高，檢測時間短，敏感度及特異度高。早期精準診斷，早期治療，避免了濫用或遲用抗生素給患兒帶來的危害，對減少MPP重癥病例、并發癥及后遺癥的發生及縮短住院時間等有一定的現實意義，有利于在全市、全省甚至全國基層醫院推廣，具有很好的應用前景。

參考文獻

[1]張慧芬，白海濤，李基明，等.肺炎支原體肺炎患兒肺炎支原體耐藥性與DNA載量和基因型的關系研究[J].中國當代兒科雜志，2017，19（11）：1180-1184.

[2]林苗苗，施李芬，余堅，等.肺炎支原體RNA和DNA檢測技術對兒童肺炎支原體肺炎診斷的價值[J].中國婦幼保健，2018，33（5）：1054-1056.

[3]胡淼，馬燕芬，李向平，等.RT-PCR檢測在疑似肺炎支原體感染患者中的應用研究[J].國際檢驗醫學雜志，2017，38（11）：1480-1481，1484.

[4]胡亞美，江載芳.諸福棠實用兒科學[M].7版.北京：人民衛生出版社，2002：1185-1191.

[5]袁紅霞，李青曌，劉巧突，等.肺炎支原體肺炎患兒肺泡灌洗液MP-DNA載量及免疫炎癥指標變化的臨床意義[J].中華醫院感染學雜志，2018，28（1）：135-138.

[6]宋建領，高華峰，信愛國，等.豬肺炎支原體實時熒光定量PCR檢測方法的建立與應用[J].畜牧與獸醫，2013，45（5）：71-74.

[7]李丹，李靜宜，董艷青，等.利用環介導等溫擴增技術檢測兒童咽拭子標本中肺炎支原體[J].山東大學學報（醫學版），2014，52（10）：55-60.

[8]李銳成，閻琳，鄒菊賢，等.961例呼吸道感染患兒

MP-DNA檢測結果分析[J].國際檢驗醫學雜志，2013，34（20）：2675-2677.

[9]李菁，包軍，鮑一笑，等.肺炎支原體肺炎患兒肺泡灌洗液病菌量及其與Th1/Th2細胞免疫應答的關系[J].臨床兒科雜志，2015，33（8）：681-685.

[10]謝輝，李基明，張慧芬，等.肺炎支原體抗體和載量指數在兒童肺炎支原體肺炎診斷中的應用[J].中國當代兒科雜志，2016，18（10）：984-987.

[11]陳雄毅，岑麗蓮，申學基，等.肺炎支原體、衣原體感染與新生兒肺炎的關系研究[J].國際檢驗醫學雜志，2017，38（13）：1847-1848.

[12]高正琴，岳秉飛，關偉鴻，等.CAR菌TaqMan MGB探針法實時熒光定量PCR快速檢測方法的建立與應用[J].中國比較醫學雜志，2013，23（8）：9-13，19.

[13]薄艷麗，戴四海.肺炎支原體肺炎患兒MPLI、肺炎支原體抗體、CRP、IL-8變化及臨床意義[J].當代醫學，2017，23（24）：63-65.

[14]成云改，李淑嫻，李雪靜，等.肺炎支原體肺炎患兒肺泡灌洗液病菌量與臨床特征相關性研究[J].中華兒科雜志，2013，51（10）：736-740.

[15]章偉，李姍姍，谷強，等.支氣管肺泡灌洗液熒光定量PCR檢測大葉性肺炎患兒肺炎支原體的效果[J].中國醫藥導報，2014，11（33）：91-93，98.

[16]王晶，甘軼文，毛李征，等.實時熒光定量PCR在兒童肺炎支原體感染中的診斷價值[J].實用臨床醫藥雜志，2015，19（15）：91-93.

[17]楊曉菲，趙翠芬，孔清玉，等.實時熒光定量PCR檢測兒童肺炎支原體16S rRNA的臨床意義[J].熱帶醫學雜志，2017，17（8）：1067-1070.

[18] Waites K B，Xiao L，Paralanov V，et al.Molecular methods for the detection of Mycoplasma and ureaplasma infections in humans：a paper from the 2011 William Beaumont Hospital Symposium on molecular pathology[J].J Mol Diagn，2012，14（5）：437-450.

[19]楊文青，呂曉麗，李銳成，等.實時熒光定量PCR檢測肺炎支原體DNA在小兒肺炎診斷中的應用價值[J].國際檢驗醫學雜志，2014，35（4）：416-418.

[20]林超群，黎運西，黎冠峰，等.血清肺炎支原體 DNA 定量對肺炎支原體感染的診斷價值[J].廣東醫學，2015，36（12）：1880-1882.