飼料中沒食子酸含量的測(cè)定高效液相色譜法

◆作者：郝燕娟 陳焱 洪英達(dá) 黃佳吟 劉麗英

◆單位：廣州匯標(biāo)檢測(cè)技術(shù)中心

沒食子酸具有抗菌抗病毒的作用，但應(yīng)用在飼料、食品方面上比較少，隨著工藝的的發(fā)展，有些企業(yè)研究將沒食子酸應(yīng)用在飼料上，但目前尚無(wú)手段對(duì)此類產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)。本文利用加熱超聲對(duì)飼料樣品進(jìn)行提取，建立了液相色譜法檢測(cè)飼料中沒食子酸的分析方法，可為加強(qiáng)日常監(jiān)控和質(zhì)量控制提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

高效液相色譜儀（配紫外檢測(cè)器），萬(wàn)分之一分析天平，超聲波清洗儀。

1.1.2 試劑與藥品

純水（符合GB/T 6682一級(jí)水的要求）、甲醇（色譜純）、磷酸（優(yōu)級(jí)純）、沒食子酸對(duì)照品（Dr.Ehrenstorfer，CAS 號(hào) 149-91-7），純度≥95%。沒食子酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 沒食子酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1.1.3 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)使用的飼料均為添加沒食子酸的混合料。按GB/T 14699.1的規(guī)定抽取有代表性的飼料樣品，用四分法縮減取樣。然后按照GB/T 20195的規(guī)定制備樣品，粉碎過后過0.45 mm孔徑的分析篩，混勻，裝入磨口瓶中，備用。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液及試劑配置

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配置

準(zhǔn)確稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品50mg（精確至 0.1mg），加水溶解并定容至50mL棕色容量瓶，此為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃保存，保存期為一個(gè)月。

1.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液的配置

取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用水逐級(jí)稀釋成約為 1μg/mL、5μg/mL、 10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱量試樣1 g（精確至0.0001 g）于150 mL磨口錐形瓶中，加入水50.0 mL，于超聲波清洗儀中70℃加熱提取30min，期間搖動(dòng)2次，取出冷卻，過濾，棄去上清液，過0.45μm濾膜，供高效液相色譜儀測(cè)定。

1.4 色譜條件

1.4.1 色譜柱

Hypersil GOLD aQ（4.6*150 mm,5μm）或相當(dāng)者。

1.4.2 色譜條件

流動(dòng)相：甲醇：0.05%磷酸（5+95）

流速：1.0mL/min

柱溫：30℃

進(jìn)樣量：20μL

圖2 對(duì)照品溶液10μg/mL

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液注入液相色譜儀，在271nm處的色譜圖見圖2與圖3，按1.4色譜條件下，沒食子酸的理論塔板數(shù)分別為17956、17650，供試品溶液中的分離度大于1.5，沒食子酸得到很好的分離。

2.2 線性關(guān)系

配制濃度約為 1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后供液相色譜儀測(cè)定。以沒食子酸色譜峰面積為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得線性方程為Y=0.7214x+0.3835。結(jié)果顯示，沒食子酸在1.2066～60.3300μg/mL 范圍內(nèi)的線性良好，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9991。

圖3 供試品溶液

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3 精密度試驗(yàn)

本文以濃度為12.0660μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液對(duì)儀器進(jìn)行精密度的測(cè)試，按1.4色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，沒食子酸的保留時(shí)間和峰面積基本穩(wěn)定，保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.11%，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.34%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批供試品（2018090949），分別在樣品處理后的 0、1、2、3、4、5、6h 進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.37%，表明溶液在6h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取飼料樣品（2018090949）6份，按1.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按1.4分別進(jìn)樣測(cè)定含量。結(jié)果樣品中沒食子酸含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.88%，說(shuō)明方法重復(fù)性良好。

2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取2.5項(xiàng)下已測(cè)含量的飼料樣品（2018090949）6份，分別稱取 0.5g，精密稱定，置于150mL三解瓶中，分別加入1206.6μg/mL沒食子酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液300μL，按1.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按1.4分別進(jìn)樣測(cè)定含量。回收率結(jié)果見表1。

3 討論與小結(jié)

采用DAD檢測(cè)器在200～400nm進(jìn)行掃描，在215和271nm波長(zhǎng)處有最大吸收，由于215nm波長(zhǎng)較短，可能產(chǎn)生干擾，故選用271nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。對(duì)流動(dòng)相的選擇，加入磷酸有助于改善峰型減少拖尾，選用甲醇-0.05%磷酸（5+95）作為流動(dòng)相，沒食子酸與其他組分色譜峰可以得到較好的分離。分別選擇超聲、加熱回流、浸泡的方法考察，結(jié)果表明超聲效果較好而且操作方便，故采用超聲方法。再對(duì)超聲 45min與 70℃超聲30min進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)70℃加熱超聲提取充分，故選擇70℃加熱超聲30min。

結(jié)果表明，在該液相色譜條件下，沒食子酸峰與相鄰的組分峰的分離度好，該方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率試驗(yàn)均符合規(guī)定。該方法操作簡(jiǎn)便、快速、可作為制定飼料中沒食子酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的參考依據(jù)。