王少熙, 陰 玥, 胡晨霞

(1.西北工業大學 微電子學院,陜西 西安 710072；2.西北工業大學深圳研究院,廣東 深圳 518057；3.廣州中醫藥大學 中醫學院,廣東 廣州 510006)

0 引 言

目前,BCSCs研究已成為腫瘤研究領域熱點，然而對腫瘤干細胞生長或分化的微環境研究卻鮮有相關資料，現有研究多集中于生理學方面微環境模擬，研究方法多具有低通量，較差空間和時間控制性，實驗重復性較差等缺陷[1～4]。不同的微環境機械因素如剪切力或基底硬度不同、不同生化信號刺激如細胞與細胞之間旁分泌及細胞自分泌類型和細胞所處空間結構的不同、傳統二維培養與腫瘤干細胞真實體內三維環境不同，都將對腫瘤干細胞的富集培養和分化產生不同影響；此外傳統方法所需過多的試劑耗材和細胞量限制了同時對多種腫瘤干細胞的研究及大批量藥物篩選。因此,受材料、空間、時間等因素的限制，傳統處理細胞的方法難以滿足腫瘤干細胞研究的需要[5]。

微流控芯片(microfluidic chip)或稱為芯片實驗室(Lab on chip)，是把化學和生物等領域中所涉及的樣品制備、反應、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊幾平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成網絡，以可控流體貫穿整個系統，用以取代常規化學或生物實驗室的各種功能的一種技術平臺[6]。2004年,美國Business 2.0雜志在封面文章中把其列為“改變未來的七種技術之一” 。2006年7月,《Nature》雜志發表了一期題為“芯片實驗室”的專輯，從不同角度闡述了芯片實驗室的研究歷史、現狀和應用前景，并認為，芯片實驗室可能成為“這一世紀的技術”[7]。由于微通道的尺寸與細胞尺寸相當，可以通過微流控芯片對細胞的研究深入到單細胞甚至亞細胞器水平，比傳統的對整群細胞進行分析的手段更加準確，對研究細胞內分子相互作用有極其重要的意義。與傳統試驗方法比較，微流控芯片具有分析速度快、高通量、成本低以及精度高等特點；芯片制作材料多為二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)，具有可塑性好、透明便于觀察、透氣性好卻不漏水、良好生物兼容性、無毒、不導電以及具有極佳的熱穩定性和化學惰性特點[9]。針對干細胞微環境因素，采用微流控芯片具有如下明顯優勢：1)微流控芯片可進行三維培養和干細胞微環境模擬及調控。微流控芯片可構建出與細胞尺度匹配的三維空間,并調控細胞生長所需的時間長短；能夠模擬體內腫瘤干細胞三維狀態下的生長狀況及與微環境中其他細胞相互作用，實現腫瘤干細胞微環境的三維培養，三維培養狀態下的細胞生長狀態良好，能夠真實地反映腫瘤干細胞的生物學特征，為微流控芯片技術在醫學和生物學研究方面提供了一個新思路。2)微流控芯片能構建腫瘤干細胞微環境中的基質材料硬度、密度、空隙率等，更為真實地反映腫瘤干細胞與物理微環境的相互作用。3)微流控芯片將生化因素整合入三維細胞微環境中；模擬微環境中的細胞因子、生長因子等對腫瘤干細胞的影響，以及能制造濃度梯度、轉移模型、細胞分離及遷移、藥物的開發及新的治療方式探索[9,10]。

綜上分析，采用微流控芯片富集培養BCSCs微球體模型，研究微流控芯片體外模擬和調控BCSCs培養的最佳微環境；設計不同的微流控芯片平臺，研究抗腫瘤化合物對BCSCs的抗腫瘤效應及作用機制；應用微流控芯片高通量、低成本篩選靶向殺傷BCSCs藥物研究等對提高乳腺癌治療效果具有重要意義。

1 芯片設計

1.1 芯片設計

乳腺癌腫瘤干細胞微流控培養的核心是實現芯片內懸浮三維培養。本項目采用多層結構設計，頂層和底層包含微通道，中間層為細胞懸浮陣列，構建形成單細胞捕獲結構陣列。中間層細胞懸浮陣列的每個位置對應頂層一個單細胞捕獲結構，當細胞遇到捕獲結構，則會在壓力場作用下緩慢落入懸浮捕獲陣列中，而陣列的每個懸浮位置只能容納單細胞，由此構建成單細胞懸浮陣列，單細胞懸浮陣列形成芯片的BCSCs培養腔。芯片結構如圖1所示。

圖1 微流控芯片結構示意

圖1中，A、B和C為輸入輸出連接口，D為閥。載有乳腺癌腫瘤干細胞的培養液從Layer1的A口注入，同時關閉D閥，當腫瘤干細胞被Layer 2的腔體陣列捕獲后，關閉A 注入口以及打開D 閥。其中,Layer 2的單個腔體陣列直徑為300 μm，高度為100 μm。然后細胞培養液可以從B 端口注入。Layer 1和Layer 3由通道組成，通道的尺寸為50 μm高，寬度為100～200 μm，具體形狀根據不同的部位改變。其中D閥處高度為10 μm。端口C為廢液出口。

1.2 芯片仿真

培養液注入的速度影響腫瘤干細胞的存活率，關鍵的參數是溶液對干細胞的剪切力。文獻[11]提出細胞富集存活受到的剪切力最大不能超過50 μN/cm2，本文采用培養液低速注入方式，仿真結果如圖2所示。

圖2 芯片內培養液流速仿真結果

1.3 芯片制造

根據芯片結構設計模具，利用模具進行芯片制造。PDMS試劑采用美國道康寧公司的Sylgard 184，按照10︰1比例配置硅膠組分和固化劑，置入真空泵去泡15 min，然后灌膠到SU8模具上放置90 ℃烘膠臺2 h。等PDMS層凝固后冷卻并剝離，得到PDMS單層芯片。原理和步驟雷同可以得到所需要的3層芯片。最后采用表面真空等離子氧化處理進行層與層對準鍵合，得出最終的芯片樣品，如圖3所示。

圖3 芯片最終樣品示意(尺寸為3 cm×5 cm)

2 實驗結果

首先進行人乳腺癌細胞系MCF—7及 MDA—MB—231腫瘤干細胞微球體的預培養，MCF—7細胞在無血清干細胞培養基，即含體積分數1 %雙抗,2 %B27,20 ng/mL EGF和20 ng/mL bFGF的DMEM/F—12培養液(SFM)中培養過程中有部分細胞呈貼壁分化的狀態，培養48h后，懸浮細胞逐漸形成較小的初始懸浮細胞團。在倒置顯微鏡下可見初始懸浮細胞團由幾個至十幾個正在分裂的新生細胞組成懸浮球，逐漸增大，且數量明顯增多，呈類圓形，折光性增強，形態大小各異。第5天開始就可觀察到典型的MCF—7腫瘤干細胞懸浮細胞球的出現。且細胞球經0.05 %胰蛋白酶消化為單細胞懸液后，仍能在SFM中生存并傳代形成第2代腫瘤干細胞球，1 w傳代一次，直至16代仍能繼續生長增殖形成腫瘤球，成功建立MCF—7腫瘤干細胞培養法。懸浮球應用含FBS培養基分化培養后，仍能貼壁增殖，但細胞形態發生變化，由原來的上皮細胞鋪路石樣形態轉為成纖維細胞樣形態。MDA—MB—231懸浮球細胞聚集相對松散，目前正在完善懸浮球培養條件(如圖4所示)。

圖4 MCF—7及 MDA—MB—231貼壁細胞及腫瘤干細胞球形態

將預培養的腫瘤干細胞球形態連同培養基注入上述所描述的芯片內，進行連續觀察富集，結果如圖5所示。

圖5 乳腺癌腫瘤干細胞片內培育示意

圖5所示微流控芯片環境下乳腺癌腫瘤干細胞的培養和富集情況，無血清培養基連續勻速提供，受到培養基動態流動的影響，單個乳腺癌腫瘤干細胞的位置有變化。在每隔2天進行實驗觀察，結果如圖5所示。

3 結 論

采用生物兼容有機化合物二甲基硅氧烷，設計3層結構微流控芯片，包括細胞及培養液注入層、中間懸浮培養層和廢液處理層。采用真空等離子氧化處理二甲基硅氧烷表面完成對準鍵合。基于此微流控芯片注入經預培養的干細胞球，實驗結果證明乳腺癌腫瘤干細胞在微流控芯片內的富集效應。