來曲唑聯合45%高脂飼料誘導生殖內分泌及代謝表型異常的多囊卵巢綜合征大鼠模型研究

尹 萍，路 璐，陳媛媛，李 麗，李 赟，童國慶

(上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海 200120)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是以稀發排卵或不排卵、高雄激素血癥為臨床特征的生殖內分泌疾病，患病率高達6%～10%，研究發現50%～60%的PCOS患者會合并胰島素抵抗(insulin resistance,IR)高胰島素血癥[1]。該病因及發病機制至今仍不完全清楚，因此，建立有效的生殖內分泌及代謝異常型多囊卵巢綜合征動物模型對其發病機制研究有重要意義。本研究采用來曲唑(letrozole)聯合45%高脂飼料飲食建模，探討更理想的生殖內分泌及代謝異常的PCOS大鼠造模方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3周齡SPF級SD雌性大鼠26只,由上海中醫藥大學動物實驗中心提供。置于室溫(18～22)℃，相對濕度40%～60%的動物房內，自由攝食、飲水，每天12 h光照。普通飼料供能比：蛋白(20%)、碳水化合物(70%)、脂肪(10%)，由上海斯萊克公司提供；高脂飼料供能比：蛋白(20%)、碳水化合物(35%)、脂肪(45%)，由深圳睿迪生物科技公司提供(D12451)。

SD大鼠隨機分為2組：對照組(普通飼料喂養)8只，另18只大鼠用于建立PCOS大鼠模型(45%高脂飼料喂養)。

1.2 藥物和試劑

來曲唑片(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，國藥準字H19991001)；羧甲基纖維素鈉(美國Sigma-aldrich公司)；胰島素酶免試劑盒(瑞典，Mercodia公司)，睪酮酶免試劑盒(美國,Immunoway公司)，羅氏血糖儀及血糖試紙(美國，Roche公司)。

1.3 PCOS模型的建立

參考文獻[2]方法：3周齡SD大鼠適應性喂養3 d，然后以高脂飼料喂養實驗組大鼠16周，第6周齡時開始每日灌胃來曲唑溶液[1mg/(kg·d)來曲唑溶于0.5%羥甲基纖維素鈉溶液中]，連續13周；普通飼料喂養對照組大鼠16周，第6周齡時開始每日灌胃0.5%羥甲基纖維素鈉溶液，連續13周，期間每周稱重。從造模第15周開始，每周對模型組和對照組大鼠尾靜脈采血，檢測空腹胰島素水平(FINS)和空腹血糖(FBG)，計算胰島素敏感指數(insulin sensitivity index ,ISI)。ISI=ln[1/(FINS×FBG)]。

模型建立成功標準：模型組大鼠體重比對照組平均體重增加20%，模型組大鼠ISI比對照組ISI均值減去1.96個標準差，陰道涂片染色鏡檢處于動情間期。第19周，12只大鼠滿足此條件，建模率達66.67%。

1.4 檢測指標

1.4.1陰道涂片

大鼠灌胃第12周，每天早上陰道涂片，HE染色，顯微鏡下觀察動情周期的變化，連續14 d。

1.4.2體重增長情況比較

每周測量大鼠的體重并且記錄。

1.4.3器官質量及臟器指數測定

大鼠腹主動脈采血取血后，將大鼠的雙側卵巢、子宮、下丘腦、垂體及腹股溝脂肪取出。組織常規稱濕重，測定臟器指數。

1.4.4卵巢組織學檢查

卵巢組織常規去除表面脂肪稱重后，一側卵巢置入4%多聚甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋后切片，做HE染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察各組大鼠卵巢組織學變化。

1.4.5大鼠腹腔糖耐量檢測(intra-peritoneal glucose tolerance test,IPGTT)

采用羅氏血糖儀及試紙測定，步驟如下:將大鼠禁食、禁水12 h，次日晨測取大鼠空腹血糖，然后將25%葡萄糖溶液按10 μl/g體重腹腔注射注入大鼠體內，注射后分別于15、30、60、90、120 min時通過尾靜脈取血，測量血糖值。

1.4.6血脂分析

大鼠禁食12 h后，尾靜脈采血，離心分離血清，測定血清中三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)的含量。

1.4.7胰島素抵抗相關指標測定

造模結束次日晨8:00，大鼠測空腹血糖，并且從腹腔采血，測FINS以及FBG，并計算ISI。

1.4.8血清學性激素測定

大鼠禁食，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，以3 000 r/min離心15 min，分離血清，置-80℃備用，檢測血清性激素睪酮(testosterone,T)水平。

1.5 統計學分析

2 實驗結果

2.1 大鼠動情周期觀察

對照組大鼠始終保持規律的動情周期變化。來曲唑灌胃后，模型組大鼠持續處于動情間期，僅見大量白細胞，偶見少量角化細胞。

2.2 大鼠體重的變化

各組大鼠在建模前體重比較無統計學差異。與對照組相比，模型組大鼠從高脂喂養第9周齡開始，體重增加極顯著(P<0.001)，見圖1。

圖1 兩組大鼠每周體重比較

2.3 大鼠臟器質量及臟器指數比較

模型組大鼠卵巢質量顯著高于對照組(P<0.05)；而模型組子宮及垂體質量以及子宮指數、垂體指數顯著低于對照組(P<0.001)；對照組腹股溝脂肪顯著低于模型組(P<0.001)；下丘腦質量在兩組間無顯著差異(表1)。

表1 各組大鼠臟器質量及臟器指數比較

*P<0.05，***P<0.001，與對照組比較

2.4 卵巢形態學變化

對照組大鼠卵巢上為正常發育的卵泡，可見多個不同發育階段的卵泡，卵泡內顆粒細胞呈多層(圖2 A、2B)。模型組卵巢為多囊樣改變，可見多個囊性擴張的卵泡，顆粒細胞層減少，膜細胞層增厚(圖2C、2D)。

圖2 各組大鼠卵巢組織病理變化的比較

2.5 大鼠腹腔糖耐量檢測

各組大鼠空腹血糖濃度無明顯差異，模型組大鼠在IPGTT后的15、30、60、90、120 min時檢測的血糖值均極顯著高于對照組(P<0.001)，見圖3， 模型組糖耐量曲線下面積(AUC)極顯著增加(P<0.001)，見圖4。

圖3 各組大鼠IPGTT血糖比較 ***P<0.001，與對照組比較

圖4 各組大鼠糖耐量曲線下面積比較 ***P<0.001，與對照組比較

2.6 大鼠血脂代謝指標比較

由表2可見，PCOS模型組大鼠與對照組比較，TG及LDL均顯著升高(P<0.05)，TC及HDL數值無差異。

表2 各組大鼠全身血清脂代謝水平變化

*P<0.05，與對照組比較

2.7 大鼠FINS及ISI變化比較

與對照組相比，模型組大鼠FINS活力顯著升高(P<0.001)，ISI敏感性顯著下降(P<0.001)，見表3。

2.8 大鼠血清睪酮水平的變化

由表4可見，模型組血清睪酮水平顯著高于對照組(P<0.05)。

表3 各組大鼠空腹胰島素水平及胰島素敏感指數的比較

***P<0.001，與對照組比較

表4 各組大鼠血清睪酮水平的比較

*P<0.05，與對照組比較

3 討論

PCOS是影響育齡期女性最常見的生殖內分泌疾病，近年來的研究表明，該疾病與胰島素抵抗、肥胖、糖尿病、心血管疾病等密切相關。有50%～60%的PCOS患者存在不同程度IR，IR促進高雄激素血癥產生，又與高雄激素血癥、高黃體生成素血癥等相互作用，影響下丘腦-垂體-卵巢軸功能，導致卵泡發育異常。在一項長達15年的回顧性分析中，Hart等的研究結果顯示PCOS女性患上肥胖、糖尿病、高血壓的概率要顯著高于正常人群[3]。在Moran等的Meta分析結果也表明PCOS女性患上2型糖尿病的概率是正常人群的4倍[4]。PCOS不僅是生殖內分泌疾病，更是一種治療上較為棘手的復雜代謝性疾病。

目前，國內外報道的PCOS的動物模型常用造模方法[5-10]中的雄激素(脫氫表雄酮、睪酮)造模法、孕激素聯合人絨毛膜促性腺激素(HCG)造模法、胰島素聯合HCG造模法及高脂飼料法，均有不同程度的胰島素抵抗，而雌激素(多采用戊酸雌二醇)造模法無明顯胰島素抵抗。多項研究[11-13]表明來曲唑造模可達到與臨床PCOS卵巢病理學改變最為接近的效果，來曲唑作為芳香化酶抑制劑，能夠阻斷雄激素向雌激素轉化，導致類固醇激素生成紊亂，卵巢局部雄激素增加，導致持續不排卵以及多囊樣改變，而來曲唑造模法糖脂代謝異常表現不明顯。大量實驗研究報道單獨給大鼠喂高脂肪和高蔗糖飼料[14-16]，可以造成大鼠肥胖高血糖及高胰島素血癥，可復制出較穩定可靠的糖脂代謝異常大鼠模型，但其性激素水平變化及卵巢形態學改變不明顯。因此，依據PCOS和糖脂代謝異常在發病學方面的聯系，采用來曲唑灌胃聯合高脂飼料喂養的方法，更適合研究PCOS發病中生殖內分泌及糖脂代謝的異常。林鶯等[2]利用來曲唑配合60%高脂飼料成功建立了胰島素抵抗型PCOS大鼠模型，朱磊等[17]單純利用不同高脂飼料構建了SD大鼠肥胖模型，發現45%高脂飼料較60%飼料具有建模快、建模率高的特點。Priya等[18]連續飼喂6周45%高脂飼料，肥胖模型大鼠生殖內分泌功能顯著下降。因此，在本研究中運用來曲唑配合45%高脂飼料造模方法，在高脂飼料喂養第6周時，模型組體重較對照組已出現顯著差異，在連續喂養16周后，成功確立了生殖內分泌及代謝異常的PCOS模型大鼠，造模率達到66.67%。

在本研究中，在來曲唑聯合高脂飼料喂養后，模型組大鼠動情周期失去規律性變化，陰道涂片并行瑞氏染色后見模型組大鼠均處于動情間期，僅見大量白細胞，可確定大鼠無排卵，模型組大鼠子宮質量減少，垂體及卵巢質量增加，卵巢HE染色可見較多囊狀擴張的卵泡，而其顆粒細胞層數明顯減少，此模型解剖及組織學改變與人PCOS相似，并且模型組大鼠的睪酮水平明顯上升，這與臨床PCOS內分泌狀態相似，與國內外研究一致[12-13,19]。在高脂飼養條件下，模型組大鼠體重及腹股溝脂肪質量極顯著高于對照組，模型組大鼠AUC、FINS、ISI、TG及LDL等指標均高于對照組，這些表型符合臨床胰島素抵抗PCOS的代謝特點。

綜上所述，利用來曲唑聯合45%高脂飼料誘導的PCOS大鼠模型表現出高雄激素、排卵障礙、卵巢多囊樣改變及糖脂代謝異常，是兼具研究PCOS內分泌及代謝異常的動物模型。