鐮形棘豆總黃酮理化性質及體外經皮滲透性的研究

蔡小輝，曾棋平，楊麗娜，曹毅祥，陳錦珊

(中國人民解放軍聯勤保障部隊第九○九醫院/廈門大學附屬東南醫院制劑科，福建 漳州 363000)

鐮形棘豆OxytropisfalcataBunge，系豆科棘豆屬多年生無莖草本植物。據《晶珠本草》記載，鐮形棘豆以根及根莖或全草入藥，被譽為“草藥之王”，是我國青藏高原常用的民間草藥之一[1]。研究表明鐮形棘豆主要藥理成分有黃酮類、生物堿類、甾體等，其中黃酮類具有鎮痛抗炎、抗氧化、抑菌等生物活性，在抗腫瘤、抗2型糖尿病及防紫外線曬傷等領域已有較多的研究[2-4]。課題組前期研究發現鐮形棘豆總黃酮(total flavonoids fromOxytropisfalcataBunge，TFOFB)干預大鼠深Ⅱ度燒傷具有良好效果[5-6]。而TFOFB的指標性成分之一——2′，4′-二羥基查爾酮也具有抗炎、鎮痛、止血、抗腫瘤、抗菌等多種作用。因此，TFOFB具有良好的開發前景，但其與體內吸收、分布、代謝密切相關的溶解度(S)、表觀油/水分配系數(LogP)、體外透皮性質等重要理化參數尚未見文獻報道。本研究以TFOFB含量為指標，考察TFOFB的溶解度、油水分配系數等理化常數，其中包括2′，4′-二羥基查爾酮的溶解度、油水分配系數，并研究TFOFB體外經皮滲透性能，為下一步經皮給藥劑型設計和制備提供實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AUW120D電子分析天平(精確至0.01 mg，日本島津公司)；UV-2550紫外可見光分光光度計(日本島津公司)；LD5-2A離心機(北京醫用離心機廠)；SHZ-B水浴恒溫振蕩器(常州科邁實驗儀器有限公司)；DLF30連續性粉碎機(溫州頂歷醫療器械有限公司)；PHS-3C型pH計(杭州雷磁分析儀器廠)；TP-3A型智能藥物透皮擴散實驗儀(鞏義市科瑞儀器有限公司)。

1.2 試藥

鐮形棘豆(購自青海西寧，經聯勤保障部隊909醫院/廈門大學附屬東南醫院鄭紹忠副主任藥師鑒定為豆科棘豆屬植物鐮形棘豆)；蘆丁對照品(純度：92.6%，中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-200707)，2′,4′-二羥基查爾酮對照品(純度：99.5%，湖北巨勝科技有限公司，批號：20171121)，甲醇、乙醇、正丁醇、正辛醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、三氯化鋁、醋酸鈉、硫化鈉(分析純)，生理氯化鈉溶液為滅菌制劑(科室自制)，水為純化水(科室自制)。

1.3 實驗動物

清潔級Wistar大鼠，雄性，體重(225±25)g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物許可證號：SCXK(滬)2012-0002。

2 方法與結果

2.1 TFOFB含量測定方法學的建立[7]

2.1.1對照品溶液的制備

取干燥至恒重的蘆丁對照品約10 mg，精密稱定，置50 ml量瓶中。加60 %乙醇適量，置 80 ℃水浴中加熱，使溶解，放冷，加 60% 乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成0.2 mg/ml的對照品溶液，備用。

2.1.2線性關系考察

精密量取“2.1.1”項下不同體積的對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml分別置入6支25 ml量瓶中，各加0.1 mol/L三氯化鋁溶液3 ml與1 mol/L醋酸鈉溶液5 ml，甲醇定容至刻度，搖勻，放置5 min，同時以相應試劑為空白，在273 nm波長處測定吸光度。以濃度(X，μg/ml)為橫坐標，吸光度值(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y=0.035X-0.127(r=0.999 9)。結果表明，蘆丁對照品溶液在8.0～48.0 μg/ml范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

2.1.3TFOFB含有量測定

精密移取TFOFB純化液1.0 ml置25 ml量瓶中，按照標準曲線的制作方法進行顯色，即加入0.1 mol/L三氯化鋁溶液3 ml及1 mol/L醋酸鈉溶液5 ml，加甲醇定容至刻度，搖勻，放置5 min，以相應試劑為空白，在273 nm 波長處測定吸光度。

2.1.4精密度試驗

精密量取對照品溶液3.0 ml，按照“2.1.2”項下方法顯色，連續測定6次，根據標準曲線計算TFOFB含量，計算RSD (n=6)，結果RSD為0.98%，表明儀器精密度良好。

2.1.5穩定性試驗

精密量取待測溶液1.0 ml置25 ml量瓶中，依“2.1.3”項下方法顯色，在120 min內，每隔20 min測定一次吸光度，計算RSD。結果RSD為1.21%，表明TFOFB純化液在120 min內穩定性良好。

2.1.6重復性試驗

稱取6份TFOFB上樣液，在優化工藝條件下上樣和洗脫，并按“2.1.3”項下方法操作，測得TFOFB含有量RSD為1.03%，表明該方法重復性良好。

2.1.7加樣回收率試驗

將蘆丁對照品溶液加到最優提取工藝條件下得到的樣品溶液(TFOFB含量為23.21 mg/g) 中，然后按“2.1.3”項下方法顯色，測定溶液吸光度，測得平均回收率為100.70%，RSD 為1.24% (n=6)。

2.2 HPLC測定2′,4′-二羥基查爾酮

2.2.1對照品溶液的制備

取2′,4′-二羥基查爾酮對照品適量，精密稱定，置于50 ml棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成164.0 μg/ml的對照品溶液。搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.2供試品溶液的制備

精密吸取TFOFB純化液1 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇適量，超聲5 min，搖勻并以甲醇稀釋至刻度，經0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.2.3色譜條件

采用Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-0.2%甲酸(50∶50)為流動相，流速1.0 ml/min；進樣量10 μl；柱溫30℃，檢測波長365 nm。

2.2.4線性關系考察

精密吸取對照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 ml至10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.2.3”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜峰面積，以峰面積對質量濃度(μg/ml)進行線性回歸，得2′,4′-二羥基查爾酮的回歸方程Y=84.108X-20.184，r=0.999 9，表明2′,4′-二羥基查爾酮在8.2～164.0 μg/ml范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.5精密度試驗

分別取低、中、高質量濃度的2′,4′-二羥基查爾酮對照品溶液(15.8、126.4、252.8 μg/ml)，用HPLC法在365 nm波長處連續測定6次峰面積，計算日內精密度，分別在5 d內每天用HPLC測定峰面積，計算日間精密度。結果2′,4′-二羥基查爾酮低、中、高3個質量濃度的日內精密度分別為1.58%、0.86%、0.75%；日間精密度分別為1.98%、0.95%、1.03%，表明儀器精密度良好。

2.2.6穩定性試驗

取同一供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件在0、1、2、4、6、12 h進樣測定峰面積，共測定6次，分別測定2′,4′-二羥基查爾酮峰面積值，結果2′,4′-二羥基查爾酮峰面積值RSD為1.08%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.2.7重復性試驗

按供試品溶液的制備方法制備6份TFOFB-CPL溶液，每份測定3次，記錄色譜峰面積，計算得2′,4′-二羥基查爾酮質量分數的RSD為0.78%。

2.2.8回收率試驗

分別精密吸取供試品溶液1 ml共9份，置于10 ml量瓶中，分別加入3份1 ml低、中、高質量濃度的(32.5、75.0、150 μg/ml)對照品溶液，混勻，再加入甲醇稀釋至刻度，超聲5 min，經0.45 μm濾膜濾過，用HPLC測定峰面積并計算加樣回收率。結果低、中、高質量濃度的2′,4′-二羥基查爾酮的回收率分別為102.35%、101.08%、100.05%，RSD分別為0.78%、1.25%、1.32%(n=3)。

2.3 TFOFB的提取及純化[7-8]

精密稱取適量鐮形棘豆粗粉，置圓底燒瓶中，加入20倍量66%乙醇回流提取2次，每次84 min，過濾，合并濾液，作為上樣液。以D-101大孔樹脂上柱，上樣濃度為275 mg/g，洗脫劑為80%乙醇，洗脫液減壓濃縮真空干燥，得純度為69.08%的總黃酮粉末。

2.4 TFOFB溶解度的測定

精密稱定TFOFB粉末或2′,4′-二羥基查爾酮0.1 g，分別加入水、甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚和不同pH的磷酸鹽緩沖液各10 ml制成過飽和溶液，于(37±1)℃、100 r/min恒溫水浴中機械振蕩，24 h后取樣，分別進行含量測定，計算TFOFB及2′,4′-二羥基查爾酮在不同溶劑中的溶解度，結果見表1。由結果可知，與純化水相比，TFOFB在甲醇、乙醇及pH 5.0～7.4的磷酸鹽緩沖液中溶解度較好；2′,4′-二羥基查爾酮難溶于水，在乙醇等有機試劑中溶解度顯著提高。

表1 TFOFB在不同溶劑中的溶解度

2.5 TFOFB表觀油水分配系數的測定

取適量水或不同pH的磷酸鹽緩沖液于錐形瓶中，加入等量的正辛醇，在振蕩器上常溫振蕩24 h，使其互相飽和，靜置分層后，分離兩相，分別保存備用。取適量的TFOFB 7份及2′,4′-二羥基查爾酮1份，分別加入被正辛醇飽和的水或緩沖溶液中，靜置后于4 000 r/min離心15 min，精密吸取上清液5 ml置于錐形瓶中，再分別加入被水/緩沖溶液飽和的正辛醇5 ml，于快速混勻器上混勻10 min，靜置1 h，靜置后取下層水相溶液以及混合前的水相溶液進行含量測定，分析TFOFB及2′,4′-二羥基查爾酮在平衡前后的質量濃度，計算表觀油水分配系數(P)公式為：

P=(C0-C1)/C1

式中，C0和C1分別為混合前后下層水相中TFOFB的質量濃度。結果見表2。由結果可知，當pH值在2.5～7.4時，隨著pH值的增加，總黃酮的logP值逐漸減小。TFOFB的logP值在0.38～1.34之間。而2′,4′-二羥基查爾酮的logP值為2.50。

表2 TFOFB在不同pH緩沖液中的表觀油水分配系數(LogP)

2.6 TFOFB體外經皮滲透性能研究[9]

2.6.1供試品的制備

取TFOFB適量，精密稱定，加60%乙醇制備濃度為10 mg/ml的供試品溶液。

2.6.2接收液的選擇

以不同溶劑作為接收液，通過考察供試品經皮滲透后的濃度，從而選出適宜的接收液，結果見表3。

2.6.3離體皮膚的制備

取同一批次的健康大鼠，適應性喂養1周后，用6%Na2S溶液將大鼠胸腹部脫毛，斷頸處死，剪下腹部皮膚，去除皮下組織和黏液組織后洗凈，置于生理鹽水中，放置于冰箱4℃保存備用。

2.6.4經皮滲透性實驗

將制備好的大鼠皮膚角質層朝上固定在改良的Franz擴散池上，保持真皮層和接受液密切接觸，并確保接收室中無氣泡，接收池(擴散面積為3.4 cm2，容積為20 ml)中加入50%乙醇生理鹽水作為接收液，內置一磁力攪拌棒，將接收池置于磁力攪拌器上，攪拌速率為300 r/min，水浴溫度為(37±1)℃。分別于1、2、4、6、8、12、24 h從接收池中吸取5 ml，同時補充等量接收液，以滿足漏槽條件。取出的接收液依法測定，計算藥物累積透過量(Qn)。透皮實驗結束后，取下皮膚，用接收液將皮膚表面殘留的供給液洗凈，剪碎，加甲醇5 ml超聲提取2次，每次30 min，取上清液進行紫外分析測定，計算藥物的皮膚滯留量(Qs)和累積透過率(Q)，平行操作3份，以不同時間的藥物累積透過量(Qn，μg/cm2)對取樣時間(t)作曲線，并對曲線中的直線部分進行線性回歸，求出的直線斜率即為穩態透皮速率[JS，μg/(cm2·h)]，直線與X軸的交點為時滯(tlag，h)。結果見表4。藥物累積透過量Qn的計算公式為：

式中，A為有效擴散面積，V為接收液總體積，ρn為第n次取樣時接收液中藥物的質量濃度，ρi為第i次取樣時接收液中藥物的質量濃度，Vi為取樣體積；

QS=Vρ/A；Q=(Q24·A) /M

式中，V為皮膚提取液總體積，ρ為皮膚提取液中藥物的質量濃度，M為供給室藥液質量。

表3 接收液的考察試驗(n=3，μg/ml)

表4 TFOFB由體外經皮滲透參數(n=3)

3 討論

黃酮類化合物是鐮形棘豆的主要活性成分，目前已分離得到的黃酮類化合物多達20余種。TFOFB具有抗氧化、抗纖維化、抑菌等作用，還可作為藥效成分用于開發抗紫外線曬傷及抗深Ⅱ度燒傷的外用制劑[2,6]。藥物理化性質的研究是藥物制劑設計的基本要素之一，因此，研究TFOFB的溶解度與表觀油水分配系數具有重要意義，溶解度可影響制劑的吸收和生物利用度，而表觀油水分配系數與制劑活性成分的溶解、吸收、分布、轉運密切相關。

本次研究表明，TFOFB溶液的親脂性強于親水性，且在弱酸及中性條件下的溶解度較好；其單體成分2′,4′-二羥基查爾酮也具有較好的親脂性。有研究報道，若化合物的logP值過低(logP<-2)則無法穿過脂質膜，logP值過高(logP>3)則會因為脂溶性強而難以從細胞另一側的膜釋放出來，最適宜經皮吸收的logP值為2.6[10]。本研究中，TFOFB的logP值在0.38～1.34之間，表明其具有一定的皮膚透過性，但透過性不高，無法實現最適宜經皮吸收的目標。而其單體成分2′,4′-二羥基查爾酮的logP值為2.24，表明透皮吸收性較好。此外，體外透皮實驗得出TFOFB累積透過率較低，且有一定的時滯，表明TFOFB經皮滲透性能差。

綜上所述，若將TFOFB開發成經皮給藥制劑，必須綜合考察藥效成分特點、制劑劑型及制備工藝等進行系統研究。比如，可加入一定量的表面活性劑、增溶劑、透皮促進劑或物理方法來增強藥物的經皮吸收，也可考慮脂質體、微乳、納米粒等經皮給藥新型載體。其中，脂質體具有類脂雙分子層結構，可攜帶藥物滲透進入不規則的脂質雙分子層，促進藥物透過皮膚，增加藥物的經皮滲透量；微乳是一種膠體分散體系，可增加藥物溶解度，提高藥物濃度梯度，促進角質層脂質雙層的流動性，并且其分散相可作為藥物儲庫；納米粒是用適宜的高分子材料制成的固態膠體分散系統，除了可在皮膚形成儲庫外，還可通過改變藥物在載體-皮膚中的分配系數調控藥物的透皮吸收過程。總之，新型載體可增加藥物溶解性，促進藥物的透皮吸收，同時具有藥物儲庫功能，有助于活性成分透過表皮層，滯留于真皮層，進而提高制劑的生物利用度。