hsa-miRNA-30a-5p促進肺癌細胞A549增殖的機制研究

周 靜，吳 杲,馬福家

(1.寧波市婦女兒童醫院，浙江 寧波，315012；2.海軍軍醫大學附屬長海醫院虹口院區,上海 200081；3.海軍特色醫學中心藥劑科，上海 200052)

我國每年新發現肺癌病例數約為70萬[1]，而肺癌致死率已上升至惡性腫瘤病死率的首位[2]，尋找新的潛在肺癌基因治療靶點，開發更為有效的肺癌治療方案，已成為關乎全民健康的迫切問題。hsa-miRNA-30a-5p定位于人6號染色體，其家族與腫瘤的相關報道多集中于肝癌及乳腺癌研究領域。A類清道夫受體5-SCARA5，位于8號染色體短臂，被稱為“低調的抑癌高手”。SCARA5在肝癌、宮頸癌和乳腺癌的發生發展中扮演著重要角色，與這些類型的腫瘤侵襲和遷移也有密切的關系[3]。但與肺癌的相關研究未見有相關報道。在本研究中，我們擬對臨床肺癌標本中的hsa-miRNA-30a-5p 和SCARA5表達及相關性做出檢測和分析，用低通量方法做進一步驗證hsa-miRNA-30a-5p與SCARA5的表達差異，同時分析兩者的相關性，在此基礎上，我們通過生物信息學分析hsa-miRNA-30a-5p 和SCARA5基因3′-UTR區的結合關系，并通過熒光素酶報告基因法進行證實，最終擬通過干預A549細胞內hsa-miRNA-30a-5p含量來調控腫瘤細胞增殖活性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人肺癌標本及癌旁組織取自解放軍第455醫院，人肺癌A549細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，RPMI1640培養基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、Lipofectamine 2000轉染試劑、RNA提取試劑盒(Trizol)及反轉錄試劑盒(M-MLV)均購自美國Invitrogen公司，熒光素酶報告基因表達載體(PGL3-promoter)和熒光素酶檢測系統(Promega公司)，SCARA5蛋白一抗及二抗均購自美國Santacruz公司，細胞及組織總蛋白提取及定量試劑盒、化學發光試劑盒均購自美國Thermo公司，miRNA合成及測序均由上海生工工程有限公司進行，MTT(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide)和二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司，無內毒素質粒DNA提取試劑盒(Qiagen公司)，熒光定量檢測試劑盒、限制性內切酶、連接酶、切膠回收試劑盒均購自Takara公司,pshRNA基因沉默表達載體(美國Systermbio公司)。

1.2 儀器和設備

細胞培養箱(美國Thermo公司)，水平離心機、高速低溫離心機以及微量移液器(Eppendorf公司)，電泳儀、垂直電泳槽及轉膜儀(上海天能公司)，酶標儀及紫外分光光度檢測儀(Thermo公司)，PCR儀(BioRad公司)。

2 實驗方法

2.1 肺癌標本中hsa-miRNA-30a-5p及SCARA5

蛋白含量檢測

收集肺腺癌及其癌旁組織5對，組織取好之后用生理鹽水漂洗，后用濾紙吸干水分，然后將組織裝入凍存管，編號后液氮保存。開始檢測實驗前，取出液氮保存的組織樣本，切取2份各200 mg左右的組織，每份組織加入1 ml經4℃預冷的Trizol，使用電動勻漿器進行組織勻漿，勻漿液4℃下以12 000×g離心2 min，收集上清液，然后酚氯仿法提取組織Total RNA。RNA通過瓊脂糖凝膠電泳觀察完整性，并通過紫外分光光度儀檢測RNA濃度。取2 μg RNA經M-MLV反轉錄制備cDNA，熒光定量法檢測組織中hsa-miRNA-30a-5p含量。另取相同大小組織，加入1 ml組織裂解液T-MER，經充分勻漿后進行組織蛋白提取和定量，實驗過程完全按照試劑盒說明書進行，蛋白提取完成后，通過Western blotting檢測組織中SCARA5蛋白相對含量。

2.2 生物信息學預測hsa-miRNA-30a-5p與SCARA5

(NM_173833.5) 3′-UTR結合位點

采用Targetscan預測軟件對SCARA5(NM_173833.5) 3′-UTR區與hsa-miRNA-30a-5p進行結合位點預測，預測結果顯示(圖2A)，hsa-miRNA-30a-5p在SCARA5的3′-UTR區存在8個堿基的種子區“5′-UGUUUACA-3′”。

2.3 載體構建

化學法合成長鏈DNA，5′-CTAGATGCATTTCAGGGACTGCATTTCAGGGAC TGCATTTCAGGGAC-3′，下游引物，5′-AGATC GTCCCTGAAATGCAGTCCCTGAAATGCAGTCCCTGAAATGCA-3′，兩端分別添加XbaⅠ酶切位點，片段包含hsa-miRNA-30a-5p與SCARA5基因3′UTR區結合位點，長鏈退火形成雙鏈DNA，后克隆至熒光素酶報告基因表達載體PGL3-promoter，重組載體經序列分析后命名為野生型熒光素酶報告基因表達載體pGL3-WT-SCARA5。使用同樣的方法將預測結合位點進行錯義突變，即由“5′-UGUUUACA-3′”突變為“5′- AUUCUGUA-3′”，構建突變型熒光素酶報告基因表達載體pGL3-MT-SCARA5，根據SCARA5(NM_173833.5)的基因信息，設計針對其編號取的siRNA序列5′-GCAACGCCAGCGAGGACAC-3′,然后根據siRNA序列設計兩條互補的長鏈DNA，上下游引物分別添加酶切位點BamHΙ和EcoRΙ及保護堿基，上游引物序列：5′- GATCCGCAACGCCAGCGAGGACAC CTTCCTGTCAGAGTGTCCTCGCTGGCGTTGCTTTTTG -3′；下游引物序列：5′- AATTCAAAAAGCAACGCCAGCGAGGACAC TCTGACAGGAAG

GTGTCCTCGCTGGCGTTGCC -3′，雙鏈DNA經退火形成雙鏈DNA，并克隆至基因表達載體，構建SCARA5基因表達載體pshRNA- SCARA5。 重組載體經序列分析無誤后，擴增轉化菌株，進行無內毒素質粒DNA提取，提取過程嚴格按照試劑盒說明書進行，使用dH2O將質粒DNA終濃度調整至500 ng/μl,-20℃保存。

化學合成miRNA-30a-5p mimics(5′ -uGuAAACAuCCuCGACuGGAAG-3′),inhibitor(5′-CuuCCAGuCGAGGAuGuuuACA-3′)及陰性對照(NC,5′-CuuCCAGuCGAGGAuGuuuACA- 3′),RNA末端加tt保護堿基。

2.4 Hsa-miRNA-30a-5p與SCARA5靶位關系的驗證

選取對數生長期的A549細胞，胰酶消化法制備細胞懸液，臺酚藍染色后使用血細胞計數板進行活細胞計數，使用完全培養基(RPMI1640+10%FBS)調整細胞密度為1×105個/ml，接種細胞于6孔板，每孔加2 ml細胞懸液，37℃和5% CO2條件下培養24 h，參照Lipofectmaine 2000轉染試劑說明書進行質粒和RNA共轉染實驗。轉染分為9組：A549對照組、pGL3-WT-SCARA5組、pGL3-MT-SCARA5組、miRNA30a-5p NC+pGL3-WT-SCARA5組、miRNA30a-NC+ pGL3-MT-SCARA5組、miRNA30a-5p mimics+pGL3-WT-SCARA組、miRNA30a-5p mimics+pGL3-MT-SCARA組、miRNA30a-5p inhibitor+pGL3-WT-SCARA組和miRNA30a-5p inhibitor+pGL3-MT-SCARA組，每組細胞轉染100 ng的海腎熒光素酶表達質粒(pGL3-TK)作為熒光霉素活性的檢測參照。A549細胞轉染后48 h，使用Promega公司的雙熒光素酶檢測系統和熒光素酶檢測儀，檢測轉染后細胞熒光素酶活性。

2.5 轉染miRNA30a-5p inhibitor對肺癌A549的影響

取對數生長期的A549細胞，0.25%胰酶消化后收集細胞，1 500×g水平離心2 min，收集細胞，使用含10%FBS的RPMI1640培養基重懸細胞，并調整細胞密度至1×105個/ml，接種細胞到6孔細胞培養板，每孔添加2 ml細胞懸液，37 ℃和5%CO2條件下培養24 h，然后進行轉染實驗，轉染過程及RNA用量完全參照試劑盒Lipofectmaine 2000說明書。實驗分為4組，A549細胞對照組、miRNA-30a NC轉染組、miRNA-30a-5p inhibitor轉染組和miRNA-30a-5p inhibitor且pshRNA-SCARA5轉染組。轉染后48 h，收集細胞，提取細胞Total RNA，熒光定量法檢測hsa-miRNA-30a-5p含量，同時，提取細胞總蛋白，用Western blotting法檢測胞內SCARA5蛋白相對含量。

2.6 A549細胞增殖活性的檢測

實驗分為4組，A549細胞對照組、miRNA-30a-5p NC轉染組、miRNA-30a-5p inhibitor轉染組和miRNA-30a-5p inhibitor且pshRNA-SCARA5轉染組。取轉染后48 h的A549細胞，胰酶消化法制備細胞懸液，離心收集細胞沉淀，用含10%FBS的RPMI1640完全培養基調整細胞密度至1×105個/ml，接種細胞到96孔細胞培養板，每孔添加100 μl細胞懸液，輕晃培養板使其分布均勻，37℃和5 % CO2條件下培養細胞，并于接種后的24、48、72 h，采用MTT法檢測細胞活性。檢測前，每孔細胞加入5 mg/ml MTT溶液10 μl，輕晃使其分布均勻，繼續培養4 h，去上清液，每孔加入150 μl DMSO溶液，37℃孵育15 min，酶標儀檢測570 nm波長(A570)細胞液的吸光度值，根據吸光度值制作細胞對數期生長曲線。

2.7 real time-PCR檢測hsa-miRNA-30a-5p含量

取2 μg 的Total RNA，反轉錄制備cDNA，反轉錄過程使用特異反轉錄引物，H.sapiens 6 snRNA:5′-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3′；hsa-miRNA-30a-5p，5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTG GAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTTCC-3′，取2 μl反轉錄產物作為PCR模板，熒光定量法檢測hsa-miRNA-30a-5p含量。2ΔΔCt法分析定量結果，內參選用U6(NM_001101.3)。PCR引物序列：U6上游引物5′-GTGCTCGCTTCGGC AGCACAT-3′，下游引物5′-TACCTTGCGAAGTGC TTAAAC-3′； hsa-miRNA-30a-5p上游引物5′-GCCGGCGCCCGAGCT CTGGCTC-3′，下游引物5′- TGTAAACATCCTCGACTGGAAG -3′。PCR使用20 μl體系，其中，SYBR Premix Ex Taq 10 μl，引物(20 μmol/L)各取0.2 μl，模板使用量為2 μl，反應體系用dH2O補足。PCR條件：95℃變性10 s；58℃退火10 s；72 ℃延伸10 s，循環數設置為40。結果分析中，以U6作為對照，通過Ct值進行數據分析。Ct值通過交點法計算獲得，即通過擴增曲線與閾值線的交點來計算Ct值。相對定量的結果則通過ΔΔCt法進行解析，目的基因相對于內參基因的表達量為2ΔCt=2Ctm-Ctn。

2.8 Western blotting檢測SCARA5蛋白含量

將濃度測定后的總蛋白以每組10μl進行垂直電泳，SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離膠濃度為10%，經110 V電壓90 min電泳后，立春紅染色觀察蛋白條帶是否完整，400 mA電流轉膜90 min，轉膜后以5%的脫脂牛奶封閉2 h，4 ℃一抗過夜孵育，SCARA5和GAPDH一抗(TBST)稀釋比分別為1∶300和1∶1 000；TBST洗膜3次，加入二抗孵育2 h，羊抗鼠二抗稀釋比為1∶2 000；TBST洗膜3次，添加化學發光液反應底物，暗室曝光，掃描曝光底片，統計目的條帶光密度值(D值)。D值目的蛋白/D值GAPDH，即為SCARA5蛋白的相對含量。

2.9 統計學方法

3 結果

3.1 腫瘤標本中hsa-miRNA-30a-5p與SCARA5蛋白含量檢測

Hsa-miRNA-30a-5p相對含量檢測數據(圖1A)顯示，與癌旁組織比較，肺癌組織中的hsa-miRNA-30a-5p含量明顯降低，組間差異顯著(P<0.05)，數據以(均值±標準差)表示，實驗設置3次獨立的生物學重復; SCARA5蛋白含量檢測結果(圖2B)顯示，肺癌組織和癌旁組織中蛋白含量分別為(1.00±0.38)和(4.29±1.18)，統計結果顯示，組間差異顯著(P<0.05)。

圖1 腫瘤標本中hsa-miRNA-30a-5p與SCARA5蛋白含量檢測 A.肺癌及癌旁組織中hsa-miRNA-30a-5p相對含量檢測結果，U6為內參；B.肺癌及癌旁組織中SCARA5蛋白表達檢測結果，GAPDH為參照蛋白；**P<0.01，與腫瘤組比較

3.2 Hsa-miRNA-30a-5p與SCARA5靶位關系驗證

生物信息學預測顯示，hsa-miRNA-30a-5p在SCARA5基因3′UTR區有8個堿基的結合位點(圖2A)。分別將miRNA-30a-5p mimics、miRNA-30a-5p inhibitor、miRNA-30a-5p NC與兩組熒光素酶報告基因表達載體pGL3-WT- SCARA5和 pGL3-MT- SCARA5進行共轉染，轉染后48 h，熒光素酶相對活性檢測結果顯示(圖2B)，miRNA-30a-5p mimics能夠明顯抑制野生型熒光素酶表達載體熒光素酶活性，從(3.98±0.61)降至(1.62±0.31)，差異具有統計學意義(P<0.05)，而miRNA-30a-5p inhibitor則能夠增強野生型熒光素酶報告基因表達載體的熒光素酶活性，(3.98±0.61)上升至(6.27±0.35)，組間差異顯著(P<0.05)；對于突變型熒光素酶報告基因表達載體，無論miRNA-30a-5p mimics或者miRNA-30a-5p inhibitor都對其無明顯影響。以上數據和結果說明，hsa-miRNA-30a-5p與SCARA5基因之間的預測靶位確實存在。

圖2 熒光素酶活性檢測 A.hsa-miRNA-124-3p與SCARA5基因3′UTR結合位點的生物信息分析；B.A549細胞轉染后24 h，細胞內熒光素酶活性檢測結果注：“+”代表轉染，“-”代表不轉染*P<0.05，**P<0.01，與pGL3-WT-SCARA5轉染組比較

3.3 轉染后A549細胞內hsa-miRNA-30a-5p及SCARA5蛋白含量檢測

A549細胞轉染miRNA-30a inhibitor后48 h，細胞內hsa-miRNA-30a-5p含量明顯降低(圖3A)，與對照組比較，差異顯著(P<0.05)，而miRNA-30a-5pNC轉染組hsa-miRNA-30a-5p含量與對照組比較，無明顯差異(P>0.05)；蛋白含量檢測結果說明(圖3B)， 轉染miRNA-30a-5p inhibitor后48 h，細胞內SCARA5含量明顯上升，與細胞對照組比較，差異顯著(P<0.05)，而miRNA-30a-5p inhibitor與沉默載體pshRNA-SCARA5共轉染組細胞內SCARA5蛋白表達與對照組比較，無明顯差異(P>0.05)。

3.4 hsa-miRNA-30a-5p含量變化對A549細胞增殖活性的影響

細胞瞬時轉染后24～72 h，各組細胞增殖活性檢測結果(圖4)顯示，轉染后48、72 h，與轉染對照組比較，miRNA-30a-5p inhibitor轉染組A549細胞增值活性明顯降低(P<0.05)，pshRNA- SCARA5與miRNA-30a-5p inhibitor轉染組細胞增殖活性則明顯增強(P<0.01)，恢復到基因干預前的水平。

圖3 轉染后A549細胞內hsa-miRNA-30a-5p及SCARA5蛋白含量檢測 A.A549細胞轉染后48 h，各組細胞內 hsa-miRNA-30a-5p含量檢測結果；B.A549細胞轉染后48 h，各組細胞內SCARA5蛋白含量檢測結果*P<0.05,與細胞對照組比較

圖4 A549細胞增殖活性檢測 **P<0.01,與細胞對照組(相同時間點)比較

4 討論

微小RNA(miRNA) 屬于內源性非編碼RNA，廣泛分布于基因組，其成熟體長度一般為20～25個堿基。從遺傳進化學角度來講，miRNA具有高度保守性。miRNA具有多種生物功能，這些功能主要通過對其靶基因的調控來實現，miRNA通過種子區可以與其靶基因3′-UTR區結合，從而抑制基因翻譯[4]。miRNA與腫瘤關系密切，可調節細胞凋亡、生長、增殖、遷移、侵襲，通過參與多種信號通路的靶蛋白的克隆形成和血管生成，參與關鍵的發病機制[5-6]。Winther等研究表明，miRNA-21可作為食管腺癌及食管鱗癌的獨立預后因素[7]。Wang等通過研究發現，miRNA-128b在胃癌的發病進程中起重要作用，過表達miRNA-128b可抑制胃癌細胞的增殖，同時誘導胃癌細胞產生凋亡[8]。miRNA-10a，miRNA-26，miRNA-126a，miRNA-210，miRNA-342和miRNA-519a被證實可以作為乳腺癌的生物學標志物，且與乳腺癌對一線用藥他莫昔芬的藥物敏感性有關[9]。miRNA-29b及miRNA17則被證實在腸癌的調控機制失活中扮演了關鍵角色[10-11]。這些研究表明，miRNA是多種腫瘤發病機制的內在原因，而其也可以成為腫瘤基因治療的切入點。過去的4年中，肺癌的總體5年生存率僅上升了4%，早期較低的診斷率是改善肺癌預后的主要障礙，肺癌切除術患者生存率大于80%，這也表明肺癌的早期檢測和診斷對提高患者的生存率至關重要，而血清中miRNA作為非侵入性肺癌生物標志物被陸續發現和證實[12]。Chen等研究證實，miRNA-25可以通過其靶基因RGS3調控非小細胞肺癌細胞株A549和H520的增殖和侵襲[13]。另外，還有miRNA-143-3p,miRNA-218,miRNA130家族[14-16]和miRNA-630[17]均與肺癌的生物學調控機制有關。所有這些研究表明，miRNAs在肺癌的發病機制中很可能形成一個網絡調控系統，對相關的miRNA進行研究，將有助于尋找新的miRNA靶基因和新的肺癌基因治療靶點[18]。

SCARA5于2009年被我國科學家發現，一系列的研究表明，SCARA5基因作為肝癌抑制基因，在肝癌組織中表達下降，SCARA5的肝癌抑制作用可能是通過抑制FAK蛋白的激活來實現的[3]。Khamas 等通過研究證實，SCARA5在腸癌中表達異常[19]。在膠質瘤細胞U251中過表達SCARA5，可以顯著抑制腫瘤細胞的增殖，顯著降低克隆形成、遷移和體外侵襲，體內實驗也表明，SCARA5過表達可以抑制皮下腫瘤的增殖[20]。Liu等通過實驗證實，SCARA5與A549細胞的EMT有關,并認為是轉錄因子SNAIL1的負調控作用所致[21]。Hsa-miRNA-30a-5p及其家族是高度保守的miRNA家族，與腫瘤發生、發展密切相關，hsa-miRNA-30a-5p下游目標包括轉錄因子如ITGB3、DTL、EWS-FLI和CD99等，通過調節這些下游目標蛋白的表達，參與調節結直腸癌、尤文瘤等類型腫瘤的發生與發展[22-24]。Hsa-miRNA-30a-5p與肺癌的相關研究較少，與SCARA5的相關研究則目前未見報道。我們在肺癌組織中驗證SCARA5的表達，數據顯示SCARA5在肺癌組織中的表達量明顯低于癌旁組織，hsa-miRNA-30a-5p在肺癌與癌旁組織中的表達與SCARA5呈顯著負相關。

我們的研究顯示，hsa-miRNA-30a-5p與SCARA5具有顯著負相關性，hsa-miRNA-30a-5p在肺癌中的高表達導致了腫瘤組織內SCARA5表達的顯著降低。MTT檢測結果顯示，通過miRNA-30a-5p inhibitor轉染可以明顯抑制A549細胞對數生長期增殖活性，當miRNA-30a-5p inhibitor與SCARA5基因沉默同時進行時，A549細胞增殖活性又恢復到基因干預前的水平。這些數據說明，miRNA-30a-5p inhibitor確實是通過抑制A549細胞內hsa-miRNA-30a-5p的表達，增強了其靶蛋白SCARA5含量，而高表達的SCARA5則明顯抑制了A549細胞的增殖活性，因此在肺癌細胞A549中，SCARA5顯然作為抑癌蛋白發揮作用。

本研究的意義在于證實hsa-miRNA-30a-5p是肺癌細胞中SCARA5蛋白低表達的主要因素，通過抑制腫瘤細胞內hsa-miRNA-30a-5p，可以顯著上調其靶蛋白SCARA5的表達，進而顯著抑制腫瘤細胞A549的增殖活性。該實驗結果提示我們，hsa-miRNA-30a-5p可成為潛在的肺癌基因治療靶點。