一種改良的Sprague Dawley新生大鼠視網膜Müller細胞培養方法

楊 梅，范 圍，黃 瑤，袁容娣

(中國人民解放軍陸軍軍醫大學第二附屬醫院眼科，重慶 400037)

Müller細胞是視網膜特有的神經膠質細胞，也是視網膜內最重要的神經膠質細胞，在視網膜的病理、生理過程中扮演著重要角色[1]。數量上，它是視網膜內數量最多的膠質細胞；結構上，Müller細胞從光感受器開始至內界膜結束，橫跨分布于整個視網膜，可維持視網膜的正常結構；功能上，其同時具備星形膠質細胞和少突膠質細胞的功能，可維持細胞微環境的平衡，還能分泌大量的神經營養因子，對視網膜神經元起到支持、滋養的作用。Müller細胞的體外培養技術可為視網膜病變的細胞生物學、發育學和電生理學等研究提供一個重要平臺。因此，在體外建立穩定的Müller細胞培養體系對于研究Müller細胞在視網膜中的生理、病理作用具有重要意義。Müller細胞培養技術的關鍵是細胞純化，細胞純化方法主要有機械吹打法、恒溫搖床法、胰蛋白酶消化法等[2-4]，這些方法均利用了Müller細胞較視網膜組織中其他細胞貼壁緊的原理。機械吹打法吹打力度和次數不易掌控，影響細胞的活性；恒溫搖床法需要在搖床震蕩4～6 h，在外界暴露時間過長，操作繁瑣，還有加重污染的風險；而胰蛋白酶消化法雖較前2種方法簡單，但在試驗中發現，單純用胰蛋白酶消化存在細胞純度不高的問題，而過度消化又會損傷細胞。為了找到一種操作簡單、細胞純度更高的培養方法，作者結合本實驗室條件，改良出一種Sprague Dawley(SD)新生大鼠視網膜Müller細胞培養方法，此方法操作簡單，獲得的細胞純度高，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物新生1～2 d的SD大鼠，雌雄不限，由陸軍軍醫大學野戰外科研究所實驗動物中心提供，本研究經陸軍軍醫大學第二附屬醫院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器高糖達爾伯克改良伊戈爾培養基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM) 購自美國Hyclone公司，胎牛血清、2.5 g·L-1胰蛋白酶購自美國Gibco公司，小鼠抗Vimentin單克隆抗體購自英國Abcom公司，熒光二抗(488)標記羊抗小鼠IgG購自英國Thermo公司，小鼠抗NeuN單克隆抗體購自美國Millpore公司；離心機、細胞培養箱、倒置熒光顯微鏡購自美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 Müller細胞原代培養將新生SD大鼠浸泡于體積分數75%乙醇中2 min，斷頭處死，摘除眼球，將眼球直接浸泡在含體積分數1%雙抗(100 U·mL-1青霉素及100 g·L-1鏈霉素)的高糖DMEM培養基中，置于37 ℃、含體積分數5%CO2的培養箱中過夜。去除浸泡眼球的培養基，加入 2.5 g·L-1胰蛋白酶溶液，置于37 ℃、含體積分數5%CO2的培養箱中消化1 h，加入含體積分數10%胎牛血清的DMEM終止消化；將眼球移入另一個無菌培養皿中，在高倍顯微鏡下分離視網膜，收集于無菌離心管中，加入含體積分數10%胎牛血清的DMEM，反復吹打，制成細胞懸液，用70 μm的濾網過濾細胞懸液，調整細胞密度，按3×105L-1接種于培養瓶中，置于 37 ℃、含體積分數5%CO2的培養箱過夜；第2天觀察細胞貼壁情況，更換培養液，繼續培養6～8 d，細胞密度達到80%予以傳代。

1.3.2 Müller細胞傳代與純化去除培養瓶中的培養基，加入2.5 g·L-1胰蛋白酶液1 mL，輕晃培養瓶，1 min后吸除胰蛋白酶溶液，重復操作2次，以去除貼附能力較差的雜細胞，純化Müller細胞。再加入2.5 g·L-1胰蛋白酶溶液2 mL，反復吹打瓶底，鏡下觀察見細胞絕大部分變圓、懸浮，立即加入含體積分數10%胎牛血清的DMEM 2 mL終止消化；將培養瓶中的細胞懸液全部轉移至無菌離心管中，1 000 r·min-1離心5 min，去上清液，加入含體積分數10%胎牛血清的DMEM，調整細胞密度，按3×105L-1接種于培養瓶中，置于37 ℃、含體積分數5% CO2的培養箱中培養4～6 d，細胞密度達到80%時進行傳代。

1.3.3 視網膜神經元純度鑒定收集第3代Müller細胞，以1.5×105L-1接種于放有載玻片的24孔板中，于37 ℃、含體積分數5%CO2的培養箱中培養48 h，去除培養基，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗3次，每次3 min，40 g·L-1多聚甲醛室溫下固定15 min，PBS洗3次，每次 3 min；體積分數0.1% Triton X-100 室溫透膜 15 min，PBS洗3次，每次3 min；體積分數10%山羊血清封閉1 h，棄血清；加入一抗小鼠抗NeuN單克隆抗體(1：500)；另取一孔用PBS代替一抗做陰性對照，4 ℃ 孵育過夜。PBS洗3次，每次3 min，加入熒光二抗(488)標記羊抗小鼠IgG(1：300)，室溫避光孵育1 h，PBS洗3次，每次3 min，1：2 000的Hoechst33342染核2 min，PBS洗3次，每次3 min。取出孔底載玻片，防熒光淬滅封片劑封片。分別在載玻片上、下、左、右、正中5個方向隨機取5個視野拍照，計數NeuN熒光(綠色)染色陽性細胞數目，神經元純度=NeuN 陽性表達細胞數/Hoechst 33342核染陽性細胞總數×100%。。

1.3.4 Müller細胞純度鑒定取“1.3.3”項下體積分數10%山羊血清封閉1 h的細胞，棄血清，加入一抗小鼠抗Vimentin單克隆抗體(1：100)，PBS代替一抗做陰性對照，4 ℃孵育過夜。去一抗，PBS洗3次，每次3 min，加入熒光二抗(488)標記羊抗小鼠IgG(1：300)，室溫避光孵育1 h，去二抗，PBS洗3次，每次3 min，1：2 000的Hoechst33342染核 2 min，PBS洗3次，每次3 min。取出孔底載玻片，防熒光淬滅封片劑封片。分別在載玻片上、下、左、右、正中5個方向隨機取5個視野拍照，計數Vimentin熒光染色陽性細胞數目，Müller細胞純度=Vimentin陽性表達細胞數/Hoechst 33342核染陽性細胞總數×100%。

2 結果

2.1 原代及傳代培養細胞生長情況培養24 h后，部分細胞已貼壁生長，散在分布；培養3 d后，細胞胞體狹長，密度約40%；培養6～8 d后，細胞已形成融合狀態，細胞體變大，細胞質豐富，細胞核呈圓形或橢圓形，密度約80%；傳至第4代的細胞形態不一，有突起，細胞體寬大，細胞質豐富，細胞核呈圓形或橢圓形，見圖1。

2.2 神經元純度鑒定將傳至第4代的原代細胞行NeuN和Hoechst33342免疫熒光染色，各視野均無陽性表達細胞，提示無神經元共生長。

2.3 Müller細胞純度鑒定傳至第4代的細胞行Vimentin和Hoechst33342免疫熒光雙染，鏡下可見大量Vimentin陽性細胞，Müller細胞純度>95%；見圖2。

圖1 傳代培養至第4代的Müller細胞形態(倒置顯微鏡，×100)

A：Hoechst33342免疫熒光核染；B：Vimentin免疫熒光細胞質染色；C：A、B圖的融合。

3 討論

Müller細胞是視網膜特有的一種神經膠質細胞，在視網膜中發揮著重要的病理、生理作用，體外培養Müller細胞是研究其病理、生理作用的重要手段[5-6]。然而，SD大鼠視網膜中細胞成分復雜，除了Müller細胞外，還含有星形膠質細胞、血管內皮細胞、神經元、少突膠質細胞等，將其中的Müller細胞分離、純化培養是該細胞培養方法的核心步驟。目前，根據Müller細胞比重、貼壁時間、黏著力、細胞壽命等方面的特性，培養和純化Müller細胞的方法較多，但各有優劣。酶消化法[7-8]和恒溫振蕩法[9]是最常用的Müller細胞純化方法，其原理均是利用Müller細胞較其他細胞容易貼壁的特點，對Müller細胞進行較好的分離和純化，但也存在著早期神經元共生長、分離視網膜操作較困難、暴露于外界時間長、易污染等不足之處。

本研究對體外培養Müller細胞的方法進行了3個方面的改良。首先，取出眼球后將其浸泡于含體積分數1%雙抗的無血清DMEM培養基中，在 37 ℃、含體積分數5%CO2的培養箱中孵育過夜。在這個孵育過程中，眼球組織處于一種缺氧的狀態，神經元和星形膠質細胞因耐受缺氧能力差而受損，而Müller細胞的耐受缺氧能力較強，在孵育過程中更利于其分裂[10]。而后，將眼球消化1 h，再分離視網膜，這與其他文獻[11]報道的先分離視網膜，再對視網膜消化的方法也有所不同。本研究中，眼球被整個消化，更有利于分離視網膜。由于選取的動物較小，分離視網膜時較難操作，而眼球消化1 h后，體積有所增大，組織變軟、變松，在去除眼前節時眼球不易滾動，更易操作，而視網膜也更易剝脫。在細胞傳代時，由于Müller細胞的貼附性最強，用胰蛋白酶反復消化2次，留取最終仍然貼壁的細胞傳代，以達到純化Müller細胞的目的，較恒溫震蕩法節省時間，減少了細胞污染的機會，并且比其他酶消化法多使用一次胰蛋白酶消化，對Müller細胞的篩選更嚴格。

視網膜中存在3種膠質細胞，即Müller細胞、星形膠質細胞和小膠質細胞。Vimentin是視網膜中Müller細胞的特異性表達蛋白[12]，因此，本研究采用Vimentin鑒定Müller細胞，Vimentin熒光染色陽性的細胞為Müller細胞。本研究熒光染色鑒定結果顯示，視野下無NeuN陽性核染細胞，說明無神經元共生長情況，而Vimentin陽性表達細胞占比>95%，均為Müller細胞。

綜上所述。本研究改良的SD新生大鼠視網膜Müller細胞培養方法操作簡單，純度高，是一種切實可行的實驗方法。