T淋巴細胞相關細胞因子在兒童免疫性血小板減少癥轉歸中的意義

王欣欣，劉 豹，郭路陽，范 蕊，任瑞娟，李培嶺，石太新

(新鄉醫學院第一附屬醫院兒科，河南 衛輝 453100)

原發性免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenic，ITP)是兒童最常見的出血性疾病，發病率為(4～5)/10萬[1]。ITP是一種自身免疫性疾病，以皮膚及黏膜自發性出血、血小板減少為主要臨床特點，大多數兒童ITP為自限性，在診斷后12個月內血小板計數可恢復正常，約10%～20%的患兒轉變為慢性ITP或難治性ITP[2]，可能與免疫功能持續紊亂有關。慢性ITP或難治性ITP患兒治療時間長，療效差，病情易反復，出血風險增加，生活質量嚴重下降。如能在發病初期或治療過程中預測ITP患兒病程，可為患兒制定個體化治療方案提供依據。國內外多項研究根據ITP患兒臨床及實驗室特征預測其病程，分析影響兒童ITP的預后因素[2-3]。但關于T淋巴細胞相關細胞因子對兒童ITP病程及預后影響的研究較少，本研究采用流式微球陣列技術(cytometric bead array，CBA)檢測ITP患兒外周血T淋巴細胞相關細胞因子水平，探討其在兒童ITP預后評估中的作用及意義；現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2016年7月至2017年12月新鄉醫學院第一附屬醫院小兒內科收治的108例ITP患兒為研究對象，其中男62例，女46例，年齡 1～156個月，中位年齡31個月。所有患兒符合ITP診斷標準[4]，且均行骨髓細胞學檢查，隨訪12個月以上，臨床及隨訪資料完整。根據隨訪結果評估患兒疾病轉歸，并將患兒分為新診斷ITP組(病程<3個月)、持續性ITP組(病程3～12個月)、慢性ITP組(病程>12個月)[4]。另選擇本院同期體檢健康兒童40例為對照組，男25例，女15例，年齡1.7～140.0個月，中位年齡55個月。納入研究前2周內無感染病史，4周內無輸血、疫苗接種史，未使用過葉酸、維生素B12、維生素B6。本研究已獲得新鄉醫學院第一附屬醫院倫理委員會批準(編號2017067)，均經受試者監護人同意后參與本研究，并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑檢測設備為美國BD公司FACS Calibur流式細胞儀。檢測試劑為美國BD公司Th1/Th2/Th17細胞因子試劑盒。

1.2.2 標本采集及檢測所有受試者于入院當天無菌采集外周血2 mL，慢性ITP組患兒治療后12個月再次采集外周血2 mL，室溫下放置20～30 min，3 000 r·min-1離心10 min，取血清，-80 ℃凍存。采用CBA技術檢測受試者血清白細胞介素(interleukin，IL)-2、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、IL-4、IL-6、IL-10及IL-17A水平，操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 各組受試者T淋巴細胞相關細胞因子水平比較結果見表1。新診斷ITP組、持續性ITP組、慢性ITP組患兒血清IL-2、IL-17A水平高于對照組，慢性ITP組患兒血清IL-2水平高于新診斷ITP組、持續性ITP組，慢性ITP組患兒血清IL-17A水平高于新診斷ITP組，差異均有統計學意義(P<0.05)；新診斷ITP組、持續性ITP組、慢性ITP組患兒血清IL-4、IL-10水平低于對照組，慢性ITP組患兒血清IL-4、IL-10水平低于新診斷ITP組，差異有統計學意義(P<0.05)；4組受試者血清IFN-γ、TNF、IL-6水平比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

表1 4組受試者T淋巴細胞相關細胞因子水平比較

注：與對照組比較aP<0.05；與新診斷ITP組比較bP<0.05；與持續性ITP組比較cP<0.05。

2.2 慢性ITP患兒治療前與治療后12個月T淋巴細胞相關細胞因子水平比較結果見表2。慢性ITP患兒治療后12個月血清IL-2、INF-γ、TNF、IL-6及IL-17A水平較治療前下降，但差異無統計學意義(P>0.05)，血清IL-4及IL-10水平較治療前升高，但差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 慢性ITP患兒治療前和治療后12個月 T淋巴細胞相關細胞因子水平比較

3 討論

ITP 是一種免疫介導的出血性疾病，其發病機制尚未完全明確，目前認為與機體細胞免疫和體液免疫異常有關。近年來，T細胞介導的免疫紊亂在ITP中的致病作用已成為共識[5-7]，活化的T細胞可直接刺激B淋巴細胞產生血小板自身抗體，加速血小板破壞，使血小板數目減少；另外，T細胞還可抑制骨髓巨核細胞的活性，使其產血小板功能降低。T細胞主要包括輔助性T細胞(helper T lymphocyte，Th)、細胞毒性T細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)和調節性T細胞(regulating T lymphocyte，Treg)。Th細胞構成機體免疫應答的中心環節，根據分泌細胞因子的作用不同分為Th1、Th2和Th17細胞，其中最重要的是Th1細胞和Th2細胞。Th1細胞產生的細胞因子IL-2、IFN-γ及TNF-β主要誘導細胞免疫；Th2細胞通過細胞因子IL-4、IL-6、IL-10和IL-13的合成誘導抗體產生。在正常情況下，Th1和Th2細胞的作用是維持免疫穩態，二者互相聯系、互相抑制，其動態平衡在維持機體正常狀態方面具有重要作用。有研究發現，ITP患者體內存在Th1/Th2比例失調，但是Th1還是Th2起主導作用尚不確定。李培嶺等[8]研究發現，急性ITP患兒血清中IFN-γ水平明顯增加，IL-4水平降低，IFN-γ與IL-4呈負相關，呈Th1優勢。另有文獻報道，慢性ITP患者的Th1/Th2比例升高，呈Th1優勢，但經過丙種球蛋白或激素治療或處于緩解期患者的Th1/Th2比例下降，趨向Th2優勢[9]。李文倩等[10]通過酶聯免疫吸附試驗測定ITP患者Th1及Th2細胞分泌的相關細胞因子水平發現，ITP患者血清IL-2、TNF-α、IFN-γ水平與健康體檢者比較差異無統計學意義，而IL-4、IL-6水平高于健康體檢者，更傾向于Th2優勢。也有研究發現，慢性ITP患者血清中Th1細胞因子水平降低，Th2細胞因子水平顯著升高[11]，表現為Th2優勢反應。

本研究通過CBA技術檢測ITP患兒Th1及Th2細胞分泌的相關細胞因子，結果顯示，新診斷ITP組、持續性ITP組、慢性ITP組患兒Th1細胞因子IL-2水平較對照組明顯升高，慢性ITP組患兒血清IL-2水平高于新診斷、持續性ITP組；新診斷ITP組、持續性ITP組、慢性ITP組患兒Th2細胞因子IL-4、IL-10水平較對照組明顯降低，慢性ITP組患兒血清IL-4、IL-10水平低于新診斷ITP組；4組受試者血清IFN-γ、TNF、IL-6水平比較差異均無統計學意義。本研究結果發現，ITP患兒血清Th1細胞因子IL-2呈高水平，Th2細胞因子IL-4、IL-10水平顯著下降，即在ITP患兒中存在Th1/Th2失衡，趨向Th1優勢型，且這一優勢在慢性ITP患兒尤為顯著，考慮可能與疾病呈慢性發展及ITP患兒體內存在免疫功能紊亂有關，而慢性ITP患兒則存在更嚴重的免疫紊亂。

Th17細胞是一類新型CD4+T細胞亞群，其特征在于產生細胞因子IL-17的能力，IL-17可以通過誘導其他炎性細胞因子(IL-6、TNF-α)及趨化因子(如單核細胞趨化蛋白-1、巨噬細胞炎性蛋白-2)的表達，介導炎癥細胞對局部的浸潤及組織損傷，同時IL-17參與中性粒細胞、樹突狀細胞的增殖、成熟及分化過程，以此加強固有免疫與獲得性免疫之間的聯系。但其是否參與ITP發病過程，是否與ITP發病機制中的Th1/Th2比例失衡存在聯系，仍存在爭議。YE等[12]和WANG等[13]報道顯示，ITP患者體內Th17細胞比例、血漿IL-17水平升高，單個核細胞內IL-17A mRNA表達水平也顯著增加。MA等[11]研究表明，與年齡、性別匹配的健康成年人比較，ITP患者血漿IL-17水平顯著降低，且重型ITP患者IL-17水平顯著低于慢性ITP患者。而MA等[14]和GUO等[15]研究發現，ITP患者Th17細胞及相關細胞因子水平與健康志愿者比較差異無統計學意義，提示Th17細胞可能在ITP發病中無明顯作用。本研究結果發現，與對照組比較，新診斷ITP組、持續性ITP組、慢性ITP組患兒血清IL-17A水平明顯升高，慢性ITP組患兒IL-17A水平高于新診斷ITP組，提示ITP患兒體內存在Th17細胞因子失衡，以IL-17A水平升高為主，且慢性ITP患兒更顯著，提示IL-17A可能參與了兒童ITP的發病，且與疾病呈長病程有關，與ROCHA等[16]研究結果一致。

本研究結果還顯示，慢性ITP組患兒治療后12個月，血清IL-2、TNF、INF-γ、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A水平與治療前比較差異無統計學意義。馬靜瑤等[17]研究提示，兒童ITP病程的遷延可能與治療后血清IL-2、TNF水平持續不降、IL-4和IL-10持續不升高有關，考慮Th1細胞持續過度活化。因此，在IL-2、IL-4、IL-10、IL-17A的共同作用下，慢性ITP患兒體內免疫紊亂持續存在，這可能是ITP患兒預后不良、呈現病程遷延的原因之一。細胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IL-17A可能能夠反映ITP患者臨床預后情況。

綜上所述，ITP患兒血清Th1細胞因子IL-2、Th17細胞因子IL-17A水平升高，Th2細胞因子IL-4、IL-10水平降低，慢性患兒更顯著，提示可能與疾病呈慢性發展有關，有助于判斷ITP患兒病情轉歸，對評估臨床預后有指導意義。