共刺激因子B7同源體4在肺腺癌組織中的表達及臨床意義

楊成軒，賈 良，孫艷霞，秦 琛，原 翔

(1.新鄉市第一人民醫院乳腺科，河南 新鄉 453000；2.河南科技大學第一附屬醫院分子生物實驗室 河南省腫瘤表觀遺傳重點實驗室，河南 洛陽 471000)

肺癌是一種嚴重威脅人體健康和生命的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌是肺癌中常見的類型，患者 5 a 生存率不超過15%[1]。肺腺癌是非小細胞肺癌的一種重要組織學亞型，早期無特異性臨床表現，僅有一般呼吸系統疾病所共有的癥狀，診斷困難，一旦出現胸部疼痛、氣促、胸腔積液等，病變已到晚期，預后極差。多年來，研究者一直努力尋找與腫瘤發生、發展、轉移及預后相關的因子[2-7]。共刺激因子B7同源體-4 (B7 homolog 4，B7H4)是新近發現的共刺激因子家族成員[8]，在多種腫瘤細胞及組織中高表達，與腫瘤免疫逃逸關系密切[9-13]。本研究旨在探討B7H4在肺腺癌及癌旁組織中的表達及其與肺腺癌患者臨床病理特征的關系，為肺腺癌的免疫治療提供新的靶點和思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2012年1月到2012年12月河南科技大學第一附屬醫院手術切除的肺腺癌患者癌組織及配對的癌旁組織(距腫瘤組織邊緣>5 cm)石蠟包埋標本為觀察對象，納入標準：(1)術后病理診斷明確為肺腺癌；(2) 患者術前均未接受放射治療、化學治療和免疫治療；(3)治療性肺腺癌切除術后；(4) 病例資料完整；(5)同時具備癌組織及配對癌旁組織。共納入肺腺癌患者組織標本100 例，男53例，女47例；年齡 38～76(61.3±10.1)歲；有吸煙史36例，飲酒史12例；高分化28例，中分化54例，低分化18例；淋巴結轉移者37例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期63例，Ⅲ+Ⅳ期37例。本研究經新鄉市第一人民醫院、河南科技大學第一附屬醫院腫瘤研究所及醫院倫理委員會審核批準，且患者簽署書面知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidin peroxidase，SP)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，B7H4兔抗人單克隆抗體購自英國Abcam公司，檸檬酸抗原修復液(pH6.0)、蘇朩精、中性樹膠、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)、二氨基聯苯胺 (diaminobenzidine，DAB)購自北京索萊寶科技有限公司；光學顯微鏡購自日本尼康公司。

1.3 免疫組織化學法檢測肺腺癌及癌旁組織中B7H4蛋白表達取常規石蠟包埋的肺腺癌及癌旁組織標本連續切片，片厚3 μm；于60 ℃溶蠟 1.5 h，二甲苯脫蠟3次，每次10 min，體積分數100%、95%、95%、85%乙醇梯度水化；95 ℃下檸檬酸抗原修復15 min，充分暴露抗原；PBS沖洗3次，每次3 min；過氧化物酶阻斷劑封閉10 min，以消除內源性過氧化物酶活性；PBS沖洗3次，每次3 min；滴加正常山羊血清封閉30 min；每張切片加入一抗(B7H4兔抗人單克隆抗體，PBS稀釋比1：200)100 μL，4 ℃孵育過夜；PBS沖洗3次，每次3 min；滴加山羊抗鼠/兔聚合物室溫下孵育30 min；PBS沖洗3次，每次3 min；滴加SP室溫封閉10 min；PBS沖洗3次，每次3 min；DAB顯色10 min；蒸餾水沖洗 10 min；蘇木精復染10 min，常規乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片；使用光學顯微鏡隨機挑選5個高倍鏡視野(×400)觀察肺腺癌及癌旁組織中B7H4蛋白的表達。采用已知陽性切片作為陽性對照，采用PBS緩沖液代替一抗為陰性對照。B7H4蛋白陽性表達判定標準：以腫瘤細胞膜及細胞質出現淺黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達。染色強度計分：無色至淺黃色為0分，棕黃色為1分，棕褐色為2分，深褐色為3分；陽性細胞百分比計分：<5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，≥75%為4分；根據染色強度和陽性細胞百分比計分的乘積對每個視野進行綜合評分，0分定義為陰性，1～12分定義為陽性，取5個視野評分均值為最終免疫組織化學評分。

2 結果

2.1 肺腺癌及癌旁組織中B7H4蛋白表達比較肺腺癌組織及癌旁組織中均可見細胞膜及細胞質出現棕黃色顆粒，B7H4蛋白表達陽性(圖1)。癌組織及癌旁組織中B7H4蛋白表達免疫組織化學評分分別為7.78±0.59、2.35±0.34，高、中、低分化癌組織中B7H4蛋白表達免疫組織化學評分分別為5.50±0.43、7.17±0.48、10.67±0.61。癌組織中B7H4蛋白表達免疫組織化學評分及高、中、低分化癌組織中B7H4蛋白表達免疫組織化學評分均顯著高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)；隨著癌組織分化程度的降低，B7H4蛋白表達免疫組織化學評分逐漸升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

A：高分化癌組織；B：中分化癌組織；C：低分化癌組織；D：癌旁組織。

2.2 B7H4蛋白表達與肺腺癌患者臨床病理特征的關系結果見表1。B7H4蛋白表達與肺腺癌患者分化程度、淋巴結轉移、TNM分期和5 a生存情況有關(P<0.05)，與患者的性別、年齡及吸煙、飲酒情況無關(P>0.05)。

表1 B7H4蛋白表達與肺腺癌患者臨床病理特征的關系

2.3 臨床病理特征與肺腺癌患者預后的關系結果見圖2、表2。COX回歸分析顯示，淋巴結轉移、TNM分期及B7H4蛋白表達為影響肺腺癌患者預后的獨立危險因素(P<0.05)。100例肺腺癌患者的術后5 a總生存率為16.00%(16/100)，其中B7H4蛋白表達陽性患者5 a生存率為2.17%(1/46)，B7H4蛋白表達陰性患者 5 a 生存率為27.78%(15/54)，B7H4蛋白表達陽性患者5 a生存率明顯低于B7H4蛋白表達陰性患者，差異有統計學意義(χ2=31.020，P<0.05)。

A：總生存曲線；B：B7H4蛋白表達陽性及陰性患者生存曲線。

表2 肺腺癌患者預后影響因素的Cox回歸分析

3 討論

肺腺癌是臨床上較為常見的惡性腫瘤，其發病率和病死率逐年升高。目前，肺腺癌的治療手段有手術治療、化學治療、放射治療等，但效果仍不理想。因此，尋找與肺腺癌發生、發展、轉移相關的因子，以預測腫瘤的發生、發展、轉移及預后情況，為免疫治療提供可能的新靶點，具有極其重要的意義。

共刺激因子B7H4是B7H共刺激因子家族成員，作為負性調節因子，在多種腫瘤及免疫逃逸機制中的作用日益受到重視[8-13]。研究表明，B7H4在乳腺癌、腎癌、結直腸癌、食管癌、肝癌等腫瘤中的表達與患者的預后相關[9-13]。B7H4在結直腸癌組織中異常高表達，并與結直腸癌的臨床病理因素相關，其表達水平則與結直腸癌患者的生存期呈負相關[11]。B7H4蛋白的表達促進了肝癌的發生、發展，癌旁肝組織中B7H4蛋白表達的高低與肝癌患者的總體生存率及腫瘤的復發密切相關，是肝癌患者獨立的預后因素，且癌旁組織B7H4高表達組更易發生早期復發或轉移[13]。B7H4在鱗狀細胞食管癌組織中高表達，其表達水平與患者遠處轉移、TNM分期顯著相關，且與患者生存期呈負相關[12]。

本研究結果顯示，肺腺癌組織中B7H4蛋白表達免疫組織化學評分顯著高于配對癌旁組織，提示B7H4 蛋白表達上調可能在肺腺癌發生、發展中扮演著重要的角色。B7H4蛋白在 TNM分期Ⅰ、Ⅱ期肺腺癌患者的陽性表達率顯著低于Ⅲ、Ⅳ期患者，在發生淋巴結轉移的肺腺癌患者的陽性表達率顯著高于無淋巴結轉移患者；表明隨著病情的惡化，B7H4表達不斷提高。另外，B7H4蛋白在低分化癌組織中的陽性表達率高于中、高分化組織，提示B7H4表達與腫瘤進展程度有關。本研究結果還顯示，B7H4為肺腺癌患者預后的獨立危險因素，其高表達與肺腺癌患者的預后相關，提示B7H4在肺腺癌瘤中可以作為預后判斷的一個標準。B7H4蛋白表達陽性患者5 a生存率明顯低于B7H4蛋白表達陰性患者，提示抑制B7H4的表達可能是肺腺癌免疫治療的潛在靶點。

綜上所述，B7H4與肺腺癌分化程度、淋巴結轉移、TNM分期有關，B7H4可能促進了肺腺癌的發生、發展，可以作為肺腺癌早期診斷和預后評估的參考依據，同時，抑制B7H4表達可能是肺腺癌免疫治療的潛在靶點之一。