嗅覺障礙小鼠嗅上皮組織中Nogo受體及其配體Nogo-A的表達及意義

周 航，王慧敏，閆義濤，盧振民，李 靖

(1.新鄉醫學院第一附屬醫院耳鼻咽喉科，河南 衛輝 453100；2.新鄉醫學院第一附屬醫院眼科，河南 衛輝 453100)

嗅覺功能障礙是神經退行性病變的主要表現[1]。嗅覺是人體的重要生理功能之一，正常人群中嗅覺功能障礙的發病率約為1.2%。嗅覺神經細胞是具有再生能力的神經元[2]，Nogo受體(Nogo receptor，NgR)是位于神經元表面的糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白，廣泛存在于中樞神經系統中，NgR與其配體Nogo-A結合后發揮多種作用，對細胞的增殖、轉移及神經的誘導、再生起重要作用[3]。而在嗅覺功能障礙發生及恢復過程中，NgR及其配體所起的作用尚不清楚，本研究采用TritonX-100建立嗅覺功能障礙小鼠模型，探討NgR及其配體在嗅覺功能障礙發生及恢復過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物8～10周無特定病原體BALB/C小鼠100只，雌雄不拘，體質量25～30 g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供。

1.2 主要試劑與儀器TRIzol試劑盒、聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒購自日本TaKaRa公司，兔抗鼠Nogo-A單克隆抗體、兔抗鼠NgR單克隆抗體購自英國Abcam公司，辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔二抗購自上海碧云天生物有限公司，Nogo-A-1酶聯免疫吸附試驗測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自美國Sigma公司；BD光學顯微鏡購自深圳博士達光學儀器有限公司，HH-ZKS4電熱恒溫水浴箱購自上海科升儀器有限公司，反轉錄-PCR(reverse transcription- PCR，RT-PCR)儀購自美國ABI公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 嗅覺功能障礙模型制備及組織標本采集將小鼠隨機分為對照組(n=20)和模型組(n=80)。將Triton X-100用生理鹽水稀釋為體積分數0.7%的實驗試劑，用鈍頭微量注射器將100 μL體積分數 0.7% Triton X-100溶液注入模型組小鼠雙側鼻腔，注射速度為100 μL·min-1。對照組小鼠同樣的方法注射100 μL生理鹽水[4]。參照文獻[5]的方法，2組小鼠分別于造模后3、7、21、49 d給予埋藏食物顆粒實驗，記錄覓食時間；小鼠在300 s(5次測試的均值)內未找到食物顆粒即判定嗅覺功能障礙模型建立成功。對照組及模型組小鼠于造模后3、7、21、49 d斷頭處死，收集小鼠嗅上皮組織，一部分于液氮凍存，用于檢測Nogo-A、NgR mRNA和NgR、Nogo-A蛋白的表達，一部分經體積分數10%甲醛溶液固定、常規石蠟包埋，用于免疫組織化學檢測。

1.3.2 免疫組織化學法檢測小鼠嗅上皮組織中NgR蛋白表達取組織切片，室溫復溫 20 min，體積分數0.3%H2O2常溫孵育30 min；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗3次，每次5 min；滴加用PBS稀釋的兔抗鼠NgR一抗(1：100)，陰性對照以PBS代替一抗，4 ℃孵育箱中過夜；PBS洗3次，每次5 min；滴加HRP標記的山羊抗兔二抗(1：1 000)，室溫孵育30 min；PBS洗3次，每次5 min；滴加過氧化物酶標記的鏈霉親和素復合物(1：100)，室溫孵育20 min；PBS 洗3次，每次5 min；用新鮮配制的 3，3′二氨基聯苯胺溶液顯色，蒸餾水終止顯色；滴加蘇木精復染1 min；漂洗干凈，返藍 5 min；梯度乙醇脫水，二甲苯透明；中性樹膠封片。選取5個視野，每個視野200個細胞，觀察小鼠嗅上皮組織中NgR表達情況，細胞膜褐色部分即為NgR表達，陽性細胞所占比例即為NgR陽性表達率。

1.3.3 RT-PCR檢測嗅上皮組織中Nogo-A及NgR mRNA表達取液氮凍存組織，復溫后采用RT-PCR法檢測Nogo-A、NgR mRNA的表達，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。采用TRIzol提取總RNA，反轉錄cDNA后備用。根據試劑盒檢測說明用PCR檢測嗅上皮組織中Nogo-A與NgR的表達水平。Nogo-A上游引物序列為5′-CGCTGGT-GCTTCTGTAGTGC-3′，下游引物序列為5′-CTTTGT-GCTGGGCTACTG-3′；NgR上游引物序列為5′-TTCTGACATTAAGGGCCGTG-3′，下游引物序列為5′-CCAGCCCACACTTCTCTCTC-3′；β-actin上游引物序列為5′-CTTCCTGGGCATGGAGTCCTG-3′，下游引物序列為5′-GGAGCAATGATCTTGATCTTC-3′。PCR反應體系：上、下游引物各0.4 μ L，Taq聚合酶 10 μL，模板2 μL，雙蒸水7.6 μL。PCR反應條件：42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，30個循環。擴增目的基因的同時擴增β-actin基因。采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量。

1.3.4 Western blot法檢測嗅上皮組織中NgR蛋白表達取液氮凍存組織，復溫后進行研磨，根據試劑盒說明書提取蛋白，按照 50 μg 蛋白的溶液體積為上樣量，向其中加入5×十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfonate，SDS)上樣緩沖液，調為l×SDS，沸水中變性10 min；將預先制備好的聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel，AGE)安裝于電泳槽中，加電泳液，用微量進樣器緊貼離心壁加入樣品。樣品經質量分數10%SDS-AGE膠120 V電泳至分離后換 80 V 電泳 60 min，300 mA恒流轉膜45 min；將膜用洗膜緩沖液(tris-buffered saline Tween，TBST)從下至上浸濕后，質量分數5%脫脂牛奶封閉2 h；TBST洗膜10 min。加入兔抗鼠的抗NgR一抗(1：100稀釋)，4 ℃孵育箱中孵育過夜；洗膜3次，加入相應的山羊抗兔的HRP標記的二抗，室溫孵育2 h，暗室壓片，曝光，顯影，定影。以兔抗鼠單克隆抗體 β-actin(1：1 000)為內參照，應用Image J 1.49軟件分析Western blot內參條帶與目的條帶的灰度比值。

1.3.5 ELISA測定嗅上皮組織中Nogo-A蛋白表達將嗅上皮組織研碎，按照 10 mg 組織對應100 μL PBS的比例進行勻漿，1 500 r·min-1離心5 min，吸取上清液，-80 ℃冰箱保存待測。采用ELISA法測定上清液中Nogo-A蛋白表達水平，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 2組小鼠嗅覺功能比較對照組小鼠覓食時間為(70.1±15.2)s；模型組小鼠造模后3、7、21、49 d 覓食時間分別為(469.2±20.4)、(495.1±31.1)、(290.3±23.3)、(130.6±28.2)s。模型組小鼠造模后3、7、21 d覓食時間長于對照組及造模后 49 d，差異有統計學意義(P<0.05)。模型組小鼠造模后49 d覓食時間與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 2組小鼠嗅上皮組織中NgR陽性表達率比較結果見圖1。模型組小鼠嗅上皮組織中NgR陽性表達較對照組顯著增強。對照組小鼠嗅上皮組織中NgR陽性表達率為18.19%(30/160)，模型組小鼠造模后3、7、21、49 d嗅上皮組織中NgR陽性表達率分別為61.21%(101/165)、84.85%(140/165)、69.10(114/165)、48.48%(80/165)，模型組小鼠造模后3、7、21、49 d 嗅上皮組織中NgR陽性表達率顯著高于對照組，差異有統計學意義(χ2=36.235、35.483、41.876、40.908，P<0.05)。

A：對照組；B：模型組造模后3 d；C：模型組造模后7 d；D：模型組造模后21 d；E：模型組造模后49 d。

2.3 2組小鼠嗅上皮組織中NgR、Nogo-A mRNA相對表達量比較結果見表1。模型組小鼠造模后3、7、21、49 d嗅上皮組織中NgR、Nogo-A mRNA相對表達量均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 2組小鼠嗅上皮組織中NgR、Nogo-A mRNA相對表達量比較

注：與對照組比較aP<0.05。

2.4 2組小鼠嗅上皮組織中NgR蛋白相對表達量比較結果見圖2。對照組嗅上皮組織中小鼠NgR蛋白相對表達量為0.22±0.04；模型組造模后3、7、21、49 d小鼠嗅上皮組織中NgR蛋白相對表達量分別為 0.85±0.03、0.87±0.02、0.86±0.02、0.39±0.01。模型組小鼠造模后第3、7、21、49 d嗅上皮組織中NgR蛋白相對表達量均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

A：對照組；B：模型組造模后3 d；C：模型組造模后7 d；D：模型組造模后21 d；E：模型組造模后49 d。

2.5 2組小鼠嗅上皮組織中Nogo-A蛋白表達比較對照組小鼠嗅上皮組織中Nogo-A蛋白表達量為(30.1±4.5)μg·L-1；模型組小鼠造模后第3、7、21、49 d嗅上皮組織中Nogo-A蛋白表達量分別為(485.2±6.3)、(490.3±5.1)、(243.2±10.1)、(123.6±4.5)μg·L-1。模型組小鼠造模后第3、7、21、49 d嗅上皮與嗅球組織中Nogo-A蛋白表達量高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

嗅覺功能障礙與多種疾病密切相關，且嗅覺功能障礙也是退行性疾病的早期信號，嚴重影響患者的生活質量[6]。嗅覺受體神經細胞是具有再生能力的神經元，雖然嗅覺功能障礙的治療取得了一定效果，但是仍有部分患者的嗅覺功能難以得到改善。嗅覺功能障礙的機制仍不十分清楚。Nogo蛋白是髓磷脂相關生長抑制蛋白的一種，在中樞神經系統軸突再生中發揮重要作用[7]。Nogo-A是含有1 163個氨基酸的大蛋白分子[8]，是Nogo的重要組成部分[9]。Nogo-A通過與NgR在神經纖維上結合而抑制其再生。本研究采用體積分數0.7%的Triton X-100建立小鼠嗅覺障礙模型，該模型未毀壞嗅上皮的基底膜，所以嗅覺可恢復，可以動態觀察嗅覺功能障礙小鼠的嗅覺變化過程。本研究結果顯示，造模后3 d，模型組小鼠的覓食時間明顯延長，且大于300 s，說明造模成功。造模后21 d，模型組小鼠的覓食時間開始較之前縮短，小鼠的功能障礙開始恢復；造模后49 d，模型組小鼠覓食時間與對照組比較差異無統計學意義，與王淵等[10]報道結果一致。

NgR是一種磷脂酰肌醇錨定蛋白，位于神經元的表面，是神經系統可塑性的重要抑制因子[11]，與其受體結合后可以抑制軸突的生長、延長。本研究通過免疫組織化學法對NgR進行定性定量分析發現，模型組小鼠嗅上皮組織中NgR蛋白表達增加，在嗅覺恢復過程中NgR蛋白表達有所減少。通過RT-PCR分析發現，模型組小鼠造模后3、7 d嗅上皮組織中Nogo-A mRNA的表達明顯升高，造模后21、49 d雖有所下降，但仍明顯高于對照組。ELISA檢測Nogo-A的表達得出相似的結果，提示NgR參與神經損傷及修復過程，從而參與嗅覺障礙過程。在既往的研究中，炎癥及腦損傷后NgR及其配體可影響星形膠質細胞的形態，從而影響腦損傷的恢復過程[12]，調節NgR信號通路可使腦損傷后軀體協調能力、認知功能等得到恢復，提示NgR參與了腦損傷的恢復過程。這與本研究結果相一致。而Nogo-A在炎癥反應中可促進經背根神經節傳導的熱痛覺過敏[13]，也可以與NgR作用后通過調節PC12 細胞中的WNK1信號通路來抑制神經元軸突的延長，從而影響神經損傷的恢復過程[14]。另一方面，Nogo-A在缺血性中樞系統疾病中抑制了血管的再生，抗Nogo-A 抗體可以保護神經元免遭缺血損傷，加快血管修復，提高血流灌注，從而為神經系統的修復提供營養[15]。本研究發現，Nogo-A表達水平在小鼠嗅覺障礙模型中升高，隨著嗅覺障礙功能的恢復Nogo-A表達水平下降。另有研究表明，在大鼠模型中，電針刺激大腦缺血灶可通過下調 Nogo-A/NgR信號通路的作用為軸突再生提供低水平的抑制環境[16]，促進神經修復；阻斷Nogo-A與NgR的作用后可以促進神經元功能恢復[17]從而促進神經生長及延長；說明NgR及其配體Nogo-A參與了神經修復的過程，下調NgR及其配體Nogo-A的表達及阻斷其相互作用可能促進小鼠嗅神經元恢復及嗅覺障礙改善。

綜上所述，在小鼠嗅覺障礙模型中，小鼠嗅上皮組織中NgR與Nogo-A表達增加，Nogo-A與NgR結合后可能參與嗅覺障礙的發生、發展。下調NgR及其配體Nogo-A的表達并阻斷其相互作用，有望為嗅覺障礙的治療提供一個新思路。