肝細胞癌中microRNA-1469表達及其對肝癌細胞生物學行為的影響

王宇鋒，朱怡鳳，殷國志

(西安交通大學第一附屬醫院肝膽外科，陜西 西安 710061)

我國肝癌發病率較高，其中約90%為肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，嚴重影響患者的身心健康[1-2]。目前，HCC的診斷與治療水平已經有了大幅提升，但HCC患者的整體預后仍然較差，手術仍是首選治療方式[1，3-6]。近年來，腫瘤靶向治療為HCC患者帶來了新的曙光，microRNA是研究較多且較為深入的一類靶點[7-14]。MicroRNA是一類長度18～25個核苷酸序列的非編碼單鏈小分子RNA，其異常表達與腫瘤的發生、發展及患者預后有密切關系[15-17]。研究發現，microRNA-1469(miR-1469)與腫瘤密切相關，在食管鱗狀細胞癌、肺癌及胃癌等多種惡性腫瘤中異常表達，可作為癌基因或抑癌基因參與調控腫瘤細胞的增殖、凋亡等多種生物學行為，且與腫瘤患者的預后密切相關[18-20]。目前，miR-1469在HCC中的表達及其對HCC細胞增殖、細胞活力、細胞周期、細胞侵襲和遷移等的影響鮮有報道。本研究旨在探討miR-1469表達與HCC患者臨床病理特征、預后的關系及其對肝癌細胞生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 標本來源選取2010年1月至2012年12月西安交通大學第一附屬醫院肝膽外科手術切除的HCC組織和對應的癌旁組織(距腫瘤邊緣>2 cm)標本各76例，男66例，女10例，年齡30～75歲，中位年齡49歲。所有患者術前未接受放射治療、化學治療及其他輔助治療，術后經病理學檢查確診為HCC。HCC組織和癌旁組織經甲醛固定，石蠟包埋保存。所有患者術后隨訪36個月。本研究獲得西安交通大學第一附屬醫院倫理委員會審核批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 細胞、試劑與儀器人正常肝細胞(LO2)及肝癌細胞HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Huh7、Bel-7402均購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清和達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)購自美國Gibco公司，TRIzol試劑購自美國Thermo Fisher Scientific公司，miRNA反轉錄試劑盒(All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit)、miRNA定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒(All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit)、miR-1469特異性引物、miRNA 內參U6引物、miR-1469過表達類似物(miR-1469 mimics)、miR-1469過表達類似物的陰性對照均購自美國Gene Copoeia公司，細胞計數試劑盒-8、流式細胞周期檢測試劑盒均購自南京凱基生物科技股份有限公司，兔抗人NDRG1單克隆抗體、兔抗人β-actin多克隆抗體購自美國Abcam公司，二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，增強化學發光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒購自美國Milipore公司；實時熒光定量PCR儀(CFX96)、全自動凝膠電泳分析系統(170-8265)購自美國Bio-rad公司，Transwell小室購自美國Corning公司，倒置相差顯微鏡購自上海繪統光學儀器有限公司，流式細胞儀(FACSCanto II)購自美國BD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實時熒光定量PCR檢測HCC組織、癌旁組織以及LO2、HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Huh7、Bel-7402細胞中miR-1469的表達應用TRIzol提取RNA技術按照TRIzol試劑說明書步驟提取收集HCC組織、癌旁組織和LO2、HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Huh7、Bel-7402細胞中的總RNA，當RNA樣品的核酸在260 nm處的吸光度值與蛋白質在280 nm處的吸光度值的比值在1.8～2.0時，樣品合格。按照miRNA反轉錄試劑盒說明書對RNA樣品進行反轉錄。20 μL反轉錄體系：總RNA 4 μL，Reaction Mix(5×)1 μg，SuperScript Enzyme Mix(10×)2 μL，然后加入焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水補足至20 μL，混勻，離心。反應條件：37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，然后置于4 ℃冰箱保存備用。依照miRNA實時熒光定量PCR試劑盒說明書進行操作。20 μL反應體系：EXPRESS SYBR Green ERTM qPCR Super Mix 10 μL，10 μmol·L-1miR-1469特異性引物或內參U6引物0.4 μL，10 μmol·L-1通用qPCR引物0.4 μL，熒光定量PCR參比染料 0.04 μL，cDNA 2 μL，DEPC處理水7.16 μL，混勻，離心。每個樣本均做3個復孔。反應條件：50 ℃預孵育2 min，95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，擴增40個循環。60 ℃延伸時采集熒光信號，反應結束后直接得到樣本的域值循環數，應用2-△△CT法處理數據。小核RNA U6為內參。每個獨立實驗重復3次。引物序列：miR-1469上游引物序列為5′-ACACTCCAGCTGGGCTCGGCGCGGGGCGCG-3′，下游引物序列為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGG-CAATTCAGTTGAGGGAGCCCG-3′；U6上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3.2 細胞培養及Hep3B和SMMC-7721細胞轉染將Hep3B和SMMC-7721細胞置于含體積分數10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的DMEM中，于37 ℃、含體積分數5%CO2的培養箱內培養。取對數生長期的Hep3B或SMMC-7721細胞，胰蛋白酶消化、離心、重懸、計數，接種于6孔板(每孔1.5×105個細胞)中繼續培養，待細胞融合度達70%時將Hep3B細胞分為miR-1469 mimics組和miR-1469 control mimics組，利用Lipofectamine 2000轉染試劑盒將miR-1469 mimics和對應的陰性對照轉染至miR-1469 mimics組和miR-1469 control mimics組Hep3B細胞；將SMMC-7721細胞分為miR-1469 inhibitors組和miR-1469 control inhibitors組，利用Lipofectamine 2000轉染試劑盒將miR-1469 inhibitors(anti-miR-1469)和對應的陰性對照轉染至的miR-1469 inhibitors組和miR-1469 control inhibitors組SMMC-7721細胞。轉染后繼續培養48 h，然后進行后續實驗。

1.3.3 實時熒光定量PCR檢測轉染后Hep3B和SMMC-7721細胞中miR-1469表達Hep3B和SMMC-7721細胞轉染48 h后應用TRIzol提取細胞總RNA，采用紫外分光光度計測定其純度及濃度，確保RNA樣品的核酸在260 nm處的吸光度值與蛋白質在280 nm處的吸光度值的比值在1.8～2.0，然后置于-80 ℃保存備用。應用miRNA反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，20 μL反轉錄體系如下：總RNA 1 μg，Reaction Mix(5×)4 μL，Super Script Enzyme Mix(10×)2 μL，然后加入DEPC水補足至20 μL，混勻，離心。反應條件：37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，然后置于4 ℃冰箱保存備用。依照miRNA實時熒光定量PCR試劑盒說明書進行操作。20 μL反應體系：EXPRESS SYBR Green ERTM qPCR Super Mix 10 μL，10 μmol·L-1miR-1469特異性引物或內參U6引物0.4 μL，10 μmol·L-1通用qPCR引物0.4 μL，熒光定量PCR參比染料 0.04 μL，cDNA 2 μL，DEPC處理水7.16 μL，混勻，離心。每個樣本均做3個復孔。反應條件：50 ℃預孵育2 min，95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃ 退火延伸1 min，擴增40個循環。60 ℃延伸時采集熒光信號，反應結束后直接得到樣本的域值循環數，應用2-△△CT法處理數據。小核RNA U6為內參。每個獨立實驗重復3次。引物序列：miR-1469上游引物序列為5′-ACACTCCAGCTGGGCTCGGCGCG-GGGCGCG-3′，下游引物序列為5′-CTCAACTGG-TGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGAGCCCG-3′；U6上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3.4 四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法檢測轉染后Hep3B和SMMC-7721細胞的增殖能力取各組轉染后48 h的Hep3B和SMMC-7721細胞接種于96孔板，每孔1.5×104個細胞，每組設3個復孔，于培養24、48、72 h每孔加入20 μL MTT溶液，繼續孵育4 h后每孔加入150 μL二甲基亞砜終止反應。在酶聯免疫檢測儀上讀取490 nm處各孔的吸光度值，每組設3個復孔，取均值，并以時間為橫坐標、抑制率為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.3.5 平板克隆形成實驗檢測轉染后Hep3B和SMMC-7721細胞克隆能力取各組轉染后48 h細胞，經消化、離心、重懸、計數后接種于6孔板中，每孔300個細胞，每組設3個復孔，輕輕搖晃培養板使細胞分散均勻。將培養板置于37 ℃、含體積分數5%CO2的培養箱中培養，當培養皿中出現肉眼可見的克隆時(約2周)終止培養，棄去培養液，使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)小心沖洗3次，甲醇固定15 min；然后，應用結晶紫對細胞進行染色30 min，用流水緩慢漂洗去除染色液，自然風干。觀察細胞克隆形成情況，50個細胞以上的細胞集落作為1個克隆，計算克隆形成數。

1.3.6 流式細胞術檢測轉染后Hep3B和SMMC-7721細胞周期細胞周期檢測按照細胞周期試劑盒說明書步驟進行。取各組轉染后48 h細胞，預冷的PBS洗滌、離心、重懸，將細胞加入預冷的體積分數70%乙醇中固定、4 ℃過夜。次日，離心后去除乙醇，PBS洗滌、重懸，加入核糖核酸酶(終質量濃度為100 mg·L-1)，37 ℃水浴30 min，加入400 μL碘化丙啶(終質量濃度為50 mg·L-1)，4 ℃避光染色 30 min，使用流式細胞儀檢測細胞周期，細胞周期擬合軟件分析數據。

1.3.7 Transwell實驗檢測轉染后Hep3B和SMMC-7721細胞的侵襲與遷移能力取各組轉染后48 h細胞，將細胞進行消化、離心，用無血清培養基進行重懸，調整細胞濃度為2×108L-1，取100 μL接種于Transwell上室(侵襲實驗的上室平鋪Matrigel膠，遷移實驗的上室未鋪Matrigel膠)，下室加入700 μL含體積分數10%胎牛血清的培養基，置于培養箱中繼續培養24 h后取出小室，用棉簽拭掉上室內殘留的細胞，40 g·L-1多聚甲醛固定，1 g·L-1結晶紫染色，顯微鏡下隨機選取5個視野(×100)計數穿膜細胞數，實驗重復3次，取均值。

1.3.8 Western blot法檢測轉染后Hep3B和SMMC-7721細胞中NDRG1蛋白表達取各組轉染后48 h細胞，棄培養基，0.01 mol·L-1PBS沖洗3次，加入細胞裂解液充分裂解，15 000 r·min-1離心15 min后取上清液，二奎啉甲酸法測定總蛋白濃度。電泳前將蛋白樣品按5：1比例加入6×上樣緩沖液，煮沸5 min后即用120 g·L-1聚丙烯酰胺凝膠電泳。4 ℃條件下23 V電壓濕轉12 h。50 g·L-1脫脂奶粉(三乙醇胺緩沖鹽水溶液溶解)室溫封閉 1 h 后加入1：1 000稀釋的NDRG1一抗及β-actin一抗，4 ℃孵育過夜，含Tween-20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液漂洗6次，每次5 min，加入二抗(按 1：10 000 稀釋)，室溫孵育1 h。Tween-20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液漂洗6次，每次5 min。暗室內浸入ECL液顯色，膠片曝光，洗片。利用ImageJ圖像分析軟件對各條帶灰度值進行分析，獲得細胞中NDRG1蛋白相對表達量。每個實驗重復3次。

2 結果

2.1 HCC組織和癌旁組織中miR-1469的表達miR-1469在HCC組織和癌旁組織中的相對表達量分別為0.71±0.03、5.49±0.04，HCC組織中miR-1469相對表達量顯著低于癌旁組織，差異有統計學意義(t=40.640，P<0.05)。

2.2 MiR-1469表達與HCC患者臨床病理特征的關系結果見表1。根據76例HCC組織中miR-1469的平均表達水平(0.71±0.03)，將高于平均表達水平的HCC患者納入miR-1469高表達組(n=33)，將低于平均表達水平的患者納入miR-1469低表達組(n=43)。miR-1469表達與腫瘤直徑、腫瘤數目、TNM分期、組織分化程度及微血管侵犯相關(P<0.05)，與患者的年齡、性別、血清甲胎蛋白水平、靜脈侵犯、Edmondson病理分級、腫瘤部位無相關性(P>0.05)。

表1 MiR-1469表達與HCC患者臨床病理特征的關系

2.3 MiR-1469表達與HCC患者預后的關系結果見圖1。Kaplan-Meier生存分析顯示，miR-1469高表達HCC患者的3 a總體生存率顯著高于低表達者(χ2=3.942，P<0.05)。

2.4 LO2、HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Huh7、Bel-7402細胞中miR-1469表達miR-1469在LO2、HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Huh7、Bel-7402細胞中的相對表達量分別為1.01±0.02、0.45±0.01、0.05±0.01、0.61±0.02、0.14±0.01、0.29±0.02；miR-1469在HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Huh7、Bel-7402細胞中的相對表達量顯著低于LO2細胞，差異均有統計學意義(t=20.370、38.490、12.320、31.650、24.840，P<0.05)；其中Hep3B細胞中miR-1469表達量最低，SMMC-7721細胞中miR-1469表達量最高。

2.5 轉染后Hep3B和SMMC-7721細胞中miR-1469表達miR-1469 mimics組和miR-1469 control mimics組Hep3B細胞中miR-1469相對表達量分別為4.47±0.15、0.05±0.01，miR-1469 mimics組Hep3B細胞中miR-1469相對表達量顯著高于miR-1469 control mimics組，差異有統計學意義(t=30.320，P<0.05)。miR-1469 inhibitors組和miR-1469 control inhibitors組SMMC-7721細胞中miR-1469相對表達量分別為0.20±0.11、1.00±0.00，miR-1469 inhibitors組SMMC-7721細胞中miR-1469相對表達量顯著低于miR-1469 control inhibitors組，差異有統計學意義(t=35.470，P<0.05)。

2.6 MiR-1469對Hep3B和SMMC-7721細胞增殖及克隆能力的影響結果見表2、表3和圖2。培養24、48、72 h時，miR-1469 mimics組Hep3B細胞增殖能力顯著低于miR-1469 control mimics組，miR-1469 inhibitors組SMMC-7721細胞增殖能力顯著高于miR-1469 control inhibitors組，差異均有統計學意義(P<0.05)。miR-1469 mimics組和miR-1469 control mimics組Hep3B細胞的克隆數分別為17.00±1.73、65.67±2.33，miR-1469 mimics組Hep3B細胞克隆形成能力顯著低于miR-1469 control mimics組，差異有統計學意義(t=16.750，P<0.05)；miR-1469 inhibitors組和miR-1469 control inhibitors組SMMC-7721細胞的克隆數分別為93.00±2.08、27.67±1.45，miR-1469 inhibitors組SMMC-7721細胞的克隆形成能力顯著高于miR-1469 control inhibitors組，差異有統計學意義(t=25.740，P<0.05)。

表2 過表達miR-1469對Hep3B細胞增殖能力的影響

表3 下調miR-1469表達對SMMC-7721細胞增殖能力的影響

A：miR-1469 control mimics組；B：miR-1469 mimics組；C：miR-1469 control inhibitors組；D：miR-1469 inhibitors組。

2.7 MiR-1469對Hep3B和SMMC-7721細胞周期的影響結果見表4和表5。與miR-1469 control mimics組比較，miR-1469 mimics組G1期Hep3B細胞顯著增多，S期Hep3B細胞顯著減少，差異有統計學意義(t=20.200、23.480，P<0.05)；但2組G2期細胞比例比較差異無統計學意義(t=0.633，P>0.05)。與miR-1469 control inhibitors組比較，miR-1469 inhibitors組G1期SMMC-7721細胞顯著減少，S期SMMC-7721細胞顯著增多，差異有統計學意義(t=4.413、6.379，P<0.05)；但2組G2期SMMC-7721細胞比例比較差異無統計學意義(t=2.214，P>0.05)。

表4 過表達miR-1469對Hep3B細胞周期的影響

表5 MiR-1469表達下調對SMMC-7721細胞周期的影響

2.8 MiR-1469對Hep3B和SMMC-7721細胞遷移和侵襲能力的影響結果見圖3。miR-1469 mimics組Hep3B細胞遷移數和侵襲數分別為59.00±2.08、29.00±2.08，miR-1469 control mimics組Hep3B細胞遷移數和侵襲數分別為35.00±1.53、20.33±1.45；miR-1469 mimics組Hep3B細胞的遷移和侵襲能力顯著高于miR-1469 control mimics組，差異有統計學意義(t=9.295、3.414，P<0.05)。miR-1469 inhibitors組SMMC-7721細胞遷移數和侵襲數分別為26.00±1.16、17.33±0.88，miR-1469 control inhibitors組SMMC-7721細胞遷移數和侵襲數分別為56.33±3.18、44.67±1.45；miR-1469 inhibitors組SMMC-7721細胞的遷移和侵襲能力顯著低于miR-1469 control inhibitors組，差異有統計學意義(t=8.966、16.080，P<0.05)。

2.9 miR-1469對Hep3B和SMMC-7721細胞中NDRG1蛋白表達的影響結果見圖4。miR-1469 mimics組和miR-1469 control mimics組Hep3B細胞中NDRG1蛋白相對表達量分別為0.23±0.04、1.00±0.00，miR-1469 mimics組Hep3B細胞中NDRG1蛋白相對表達量顯著低于miR-1469 control mimics組，差異有統計學意義(t=17.760，P<0.05)；miR-1469 inhibitors組和miR-1469 control inhibitors組SMMC-7721細胞中NDRG1蛋白相對表達量分別為3.90±0.17、1.00±0.00，miR-1469 inhibitors組SMMC-7721細胞中NDRG1蛋白相對表達量顯著高于miR-1469 control inhibitors組，差異有統計學意義(t=16.740，P<0.05)。

A：miR-1469 control mimics組；B：miR-1469 mimics組；C：miR-1469 control inhibitors組；D：miR-1469 inhibitors組。

1：miR-1469 control mimics組；2：miR-1469 mimics組；3：miR-1469 control inhibitors組；4：miR-1469 inhibitors組。

3 討論

HCC是原發性肝癌的主要組織學類型，是最常見的惡性腫瘤之一，具有較高的發病率和致死率，因此，提高HCC的診斷與治療水平具有重要意義[21-23]。近年來，以microRNA為代表的靶點是研究熱點之一[24-26]。MicroRNA主要通過與靶mRNA的3′端非編碼區域(3′-untranslated region，3′-UTR)互補配對而在轉錄后水平對基因的表達進行負調控，導致mRNA降解或翻譯抑制[17]。隨著研究的不斷深入，發現異常表達的microRNA與多種腫瘤的發生、發展密切相關。研究發現，miR-1469在食管鱗狀細胞癌、肺癌及胃癌等多種惡性腫瘤中存在異常表達，可作為癌基因或抑癌基因參與調節腫瘤細胞的增殖、凋亡等多種生物學行為，且與腫瘤患者的預后密切相關，對判斷腫瘤的惡性程度及患者預后具有一定的臨床參考價值[18-20]。

本研究結果顯示，miR-1469在HCC組織和細胞中的表達均顯著下調，且與腫瘤直徑、腫瘤數目、TNM分期、組織分化程度及微血管侵犯顯著相關，miR-1469低表達HCC患者的3 a總體生存率顯著低于高表達者；該結果提示，miR-1469可能是HCC的抑癌基因，對判斷HCC的惡性程度及患者預后具有一定的臨床參考價值。本研究結果顯示，上調HCC細胞中miR-1469表達水平后，HCC細胞的活力、克隆形成能力、細胞周期及細胞侵襲、遷移能力均受到顯著抑制；而下調HCC細胞中miR-1469表達水平后，上述生物學功能明顯增強；該結果表明，miR-1469高表達可抑制HCC細胞的增殖能力，誘導腫瘤細胞的細胞周期阻滯，并抑制HCC細胞的侵襲、遷移能力；miR-1469為HCC的抑癌基因，可以通過抑制HCC細胞的增殖、細胞周期、侵襲及遷移而發揮其抗腫瘤作用。

為進一步探究miR-1469的作用機制，本研究應用生物信息學數據庫(http：//www.microrna.org/microrna/home；http：//www.targetscan.org)預測miR-1469的下游靶點，發現NDRG1是上述數據庫共同預測的靶點之一。NDRG1的3′-UTR具有與miR-1469結合的區域，已證實NDRG1為HCC的促癌基因。本研究結果顯示，過表達Hep3B細胞中的miR-1469后，NDRG1的表達水平明顯下調；而抑制SMMC-7721細胞中的miR-1469的表達后，NDRG1的表達水平顯著上調；該結果提示，HCC細胞中的NDRG1可能為miR-1469的作用靶點。有研究表明，HCC細胞中過表達的NDRG1能夠競爭性結合GSK-3β和Nur77，從而減少β-catenin的降解，進而激活Wnt/β-catenin通路[27]。筆者推測，HCC細胞中miR-1469能夠通過靶向結合并降低NDRG1表達，從而促進β-catenin的降解，抑制Wnt/β-catenin通路，進而抑制HCC進展；但其具體作用機制有待進一步研究。

綜上所述，miR-1469在HCC中表達下調，且與腫瘤數目、腫瘤直徑、TNM分期、組織分化程度、微血管侵犯及患者預后密切相關；miR-1469可以通過靶向結合NDRG1并抑制其表達從而抑制HCC細胞的增殖、周期、侵襲和遷移。本研究為進一步了解HCC發生、發展的分子機制及尋找新的分子治療靶點奠定了一定的基礎。