鐵皮石斛粉對SD大鼠致畸作用研究

劉泳廷，高敏，劉佳，鄭沖，劉玲，葉建方，苑潔

(貴州省疾病預防控制中心，貴州 貴陽 550004)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)為蘭科石斛屬多年生草本植物，別名黑節草、鐵吊蘭，是石斛屬植物中藥用價值最高的一種石斛。以新鮮或干燥的莖入藥，作為滋陰清熱、益胃生津潤肺的傳統中藥，具有悠久的食用和使用方面的歷史[1-3]。近年來，國內外學者對鐵皮石斛的化學成分、藥理活性和質量控制方法均開展了大量的研究。研究表明,鐵皮石斛的成分主要為多糖和生物堿，含有少量的糖苷、菲類、聯芐類和氨基酸等[4-5]，具有抗衰老、抗腫瘤、降低血糖、提高免疫功能等作用，對惡性腫瘤、胃腸道疾病、糖尿病、白內障、關節炎、血栓閉塞性脈管炎及慢性咽炎等有很好的療效，治療和保健意義非常重大[6-12]。但目前有關鐵皮石斛及其同類產品毒理學安全性評價研究的資料少見報道，且未見生殖毒性及致畸作用的相關研究報道。貴州由于優越的地理位置及良好的生態環境,境內曾擁有豐富的野生鐵皮石斛資源,是鐵皮石斛的原產地之一[13-14]。本次研究擬對貴州產鐵皮石斛粉致畸作用進行試驗研究，旨在了解鐵皮石斛粉對SD大鼠是否具有胚胎毒性和致畸毒性。

1 材料與方法

1.1 受試物

鐵皮石斛粉為淺黃綠色粉末，由貴州某藥業公司提供。人體口服推薦量為每日1.5 g。

1.2 對照藥物

阿司匹林(規格：100 mg，批號：160528，上海藍季科技發展有限公司)；陰性對照為蒸餾水。

1.3 實驗動物及環境

SPF級健康成年SD大鼠，雌性120只(體質量230～260 g)，雄性60只(體質量300～330 g)，由貴州醫科大學實驗動物中心提供：SCXK(黔)2018-0001。動物質量合格證號：1202129。實驗室屏障環境動物使用許可證：SYXK(黔)2014-001。溫度：20℃～26℃,濕度：40%～70%。SPF級繁殖飼料由四川省醫學科學院四川省人民醫院實驗動物研究所提供：SCXK(川)2015-01。

1.4 試驗方法

1.4.1 分組與處理

實驗共分5組，陰性對照組、陽性對照組及3個劑量組。按最大灌胃量法給予樣品，劑量設計如下：鐵皮石斛粉0.63 g/kgBW、1.25 g/kgBW和2.50 g/kgBW，相當于人體推薦攝入量的25倍、50倍和100倍，陰性對照組為蒸餾水，陽性對照組為阿司匹林(250 mg/kgBW)。低、中、高劑量組受試物配制為分別稱取樣品6.3 g、12.5 g、25.0 g加蒸餾水定容到150 mL；陽性對照組配制為稱取阿司匹林2.5 g加蒸餾水定容到150 mL。每日即配即用，各組灌胃量均為15 mL/kgBW，每天1次。

1.4.2 方法

SD大鼠雌、雄按1:1合籠過夜后，每日早晨觀察陰栓，查出陰栓認為該鼠已交配，當日作為“受孕”零天。確認的“孕鼠”隨機分到各組，每組20只，并稱重、編號，在受孕的第6～15天，各組每天經口給予受試物(灌胃體積15 mL/kgBW)。在0、6、9、12、15和20天分別稱體質量一次，按體質量調整受試物灌胃量，并予記錄，自由進食飼料。第20天頸椎脫臼處死母體，剖腹取出子宮，稱子宮連胎重，記錄黃體數、著床數、吸收胎、早死胎、晚死胎及活胎數，逐一記錄胎鼠性別、體重、體長、胎盤重及外觀有無畸形。每窩1/2活胎放入95%的乙醇中固定后放入10 g/L的氫氧化鉀溶液內，透明后放入茜素紅應用液中染色，在體視顯微鏡下檢查有無骨骼畸形。另1/2活胎放入Bouins液固定2周后作內臟檢查。

1.5 統計分析

應用SPSS18 FORWINDOWS統計處理，計量指標的組間差異采用方差分析，計數指標的組間差異采用卡方檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 對孕鼠一般狀況及體質量的影響

在整個試驗期間，各組孕鼠均未見異常癥狀和體征，也無死亡。陰性對照組孕鼠在整個妊娠期體質量增長正常。鐵皮石斛粉低、中、高劑量組各時間點體質量增長正常，與陰性對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。陽性對照組孕鼠在妊娠第12天體質量增長減慢，顯著低于陰性對照組(P<0.05)，見表1。

表1 鐵皮石斛粉對孕鼠體質量的影響

注：與陰性對照組比較，*P<0.05。

2.2 對孕鼠胚胎發育的影響

陰性對照組子宮連胎重、黃體數、著床數、活胎數和胎鼠體質量、身長、胎盤重等均正常。鐵皮石斛粉低、中、高劑量組平均活胎體質量、平均活胎體長、平均胎盤重與陰性對照組比較有統計學差異(P<0.05)，但無明顯的劑量-反應關系，且均在本實驗室基礎數據正常范圍內，其余指標與陰性對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)。陽性對照組吸收胎率顯著高于陰性對照組(P<0.01)；子宮連胎重、平均活胎體重、平均活胎體長均顯著低于陰性對照組(P<0.01)，說明阿司匹林有明顯的胚胎毒性。各劑量組均未出現死胎，外觀檢查僅陽性對照組有3只胎鼠腦膨出合并脊柱裂，外觀畸形率1.50%，見表2和表3。

注：與陰性對照組比較，**P<0.01。

表3 鐵皮石斛粉對活胎鼠生長發育的影響

注：與陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 對胎鼠骨骼的影響

鐵皮石斛粉各劑量組胎鼠骨骼改變主要為胸骨缺失、胸骨骨化不全、14對肋和短肋，與陰性對照組比較無顯著性差異(P>0.05)，表明鐵皮石斛粉對胎鼠骨骼分化無不良影響。陽性對照組胎鼠骨骼畸形主要為頭骨骨化異常、脊椎椎體分岔、椎體單側骨化、頸椎間隙增寬、15對肋、胸骨缺失，畸形率高達98.95%，顯著高于陰性對照組(P<0.01)，見表4、圖1。

表4 鐵皮石斛粉對胎鼠骨骼發育的影響

注：與陰性對照組比較，**P<0.01。

2.4 對胎鼠內臟的影響

鐵皮石斛粉低、中、高劑量組和陰性對照組未發現有內臟畸形；陽性對照組見內臟異常胎鼠數13只，主要為臟器淤血，并見側腦室擴張2只、腎盂擴張2只、腎偏小1只，內臟畸形率12.38%，顯著高于陰性對照組(P<0.01)，見表5。

3 討論

致畸作用是發育毒性中最主要的一種表現，通過檢測妊娠動物接觸受試物后引起的致畸可能性，可預測其對人體可能的致畸性，是衡量外來化合物發育毒性的重要指標。母體在孕期受到可通過胎盤屏障的有害物質的作用，會影響胚胎的器官分化與發育，導致結構異常，出現胎鼠畸形。因此，在受孕動物的胚胎著床后，器官形成期給予受試物，可檢出該物質對胎鼠的致畸作用。本次研究用鐵皮石斛粉在孕鼠的致畸敏感期進行染毒，不但能檢測鐵皮石斛粉的致畸性，還可以觀察其致胚胎、胎鼠死亡和生長遲緩等資料。

注：①⑤陰性對照組；②③④⑦⑧陽性對照組(箭頭所示分別為②囟門偏大，③枕骨Ⅰ級，④囟門偏大、枕骨骨化不全,⑦雙側波形肋，⑧第14胸椎椎體單側骨化，第11、12胸椎椎體分岔)；⑥鐵皮石斛高劑量組：雙側短肋。圖1 體視顯微鏡下觀察阿司匹林和鐵皮石斛粉對胎鼠骨骼發育的影響

組別受檢胎鼠數頭部胸部腹部內臟畸胎數內臟畸形率(%)腦/腦室出血圍腦膜下出血側腦室擴張小眼/無眼胸腔淤血肺偏小腹腔淤血肝淤血腎臟偏小腎盂擴張陰性對照組124000000000000.00低劑量組116000000000000.00中劑量組113000000000000.00高劑量組118000000000000.00陽性對照組10521203021121312.38**

注：與陰性對照組比較，**P<0.01。

本次研究中，設定的陽性對照物為阿司匹林，劑量250 mg/kgBW，實驗孕鼠呈現明顯的胚胎毒性和致畸胎作用，其中子宮連胎重、平均活胎體質量、平均活胎體長均顯著低于陰性對照組，外觀檢查有3只胎鼠見腦膨出合并脊柱裂，吸收胎率9.91%，骨骼畸形率98.95%，內臟畸形率12.38%，均顯著高于陰性對照組，這與本實驗室以往設立的陽性對照模型結果相吻合，提示本次研究所選SD大鼠種屬對致畸物反應敏感。

本次研究采用最大灌胃量法設計給予受試物，因鐵皮石斛粉為一種易吸水、黏稠度高的物質，故設計的最高劑量為2.5 g/kgBW，達到每日人體推薦劑量的100倍。實驗期間未見孕鼠進食量減少及其他母體中毒癥狀，鐵皮石斛粉各劑量組孕鼠增重、黃體數、著床數、活胎數、吸收胎數和死胎數未見異常，對胎鼠體質量、胎盤重、身長、骨骼和內臟也未見明顯影響。鐵皮石斛粉在達到人體推薦量100倍的劑量對大鼠未顯示明顯的母體毒性、胚胎毒性和致畸性，致畸毒性的無明顯有害作用水平為2.5 g/kgBW，提示鐵皮石斛粉對人體可能無明顯的致畸作用。本次研究為鐵皮石斛作為藥物、保健食品、新食品資源的開發利用提供了生殖毒理學參考依據。