蔥白提取物對動脈粥樣硬化大鼠血管內膜脂質沉著及Bcl-2、PPARγ蛋白表達的影響

夏雯，雷杰，段剛峰，鄭瓊莉

(武漢市中西醫結合醫院，湖北 武漢 430022)

動脈粥樣硬化(Atheroschlerosis,AS)是心、腦血管疾病的重要病因，以脂質沉積，內膜增厚及斑塊形成為主要表現。而內皮細胞功能損傷是AS形成初期的重要環節。內皮細胞功能異常會引發血管損傷,引起AS的發生發展。B淋巴細胞瘤-2蛋白(Bcl-2)作為凋亡調控基因,對AS過程中的脂質氧化應激和炎癥發生起到重要作用。而過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)作為轉錄調節因子，參與了脂質代謝、炎癥及動脈粥樣硬化的發生。《本草綱目》記載：蔥白治療“心急痛，牙關緊閉欲絕”，與現代醫學冠心病癥狀相近。蔥白提取物是從蔥科植物細香蔥(BulbusAlliiFistulosi)成熟莖下端蔥白中提取的活性成分，前期實驗發現,蔥白提取物對急性心肌缺血大鼠心肌損傷具有保護作用[1-2]。本實驗基于以上研究，擬建立動脈粥樣硬化大鼠模型，觀察蔥白提取物對AS大鼠血管脂質沉著及Bcl-2、PPARγ蛋白表達的影響，為進一步闡明蔥白提取物抗動脈粥樣硬化機制提供實驗支撐。

1 材料

1.1 動物

健康雄性SD大鼠，體質量(200±20)g，40只，由湖北省實驗動物研究中心提供(動物合格證編號：No.42000600000069)。動物飼養于塑料籠內,每籠4只,自由飲用去離子水,室內溫度為25℃,溫度為60%,水及飼料均經過輻照消毒處理。

1.2 藥品及試劑

蔥白提取物(批號：20150326，武漢市中醫西結合醫院提供，經微波干燥和超臨界萃取得到，干燥蔥白超臨界萃取的總得率在1.85%左右，主要含有含硫化合物、甾體、皂苷、不飽和脂肪酸等化合物，濃度為25%，配置成最終濃度為0.10 mg/mL的溶液)；辛伐他汀片(舒降之,批號：02001697，杭州默沙東制藥有限公司，配置成最終濃度為10 mg/mL的溶液)；膽固醇、膽酸鈉、丙基硫氧嘧啶和維生素D3粉劑(武漢宇陽鋒銳生物科技有限公司)；其余試劑均為市售分析純。

1.3 儀器

低溫高速離心機(Sorvall Stratos，賽默飛，美國)；超低溫冰箱(MDF-390AT， SANYO，日本)；組織包埋機(Leica公司，德國)；組織切片機(Leica公司，德國)；熒光顯微鏡(CX22，OLYMPUS公司，日本)；全自動生化分析儀(AU2700，貝克曼公司，美國)；垂直電泳儀(JY-SCZ，北京六一儀器廠)；凝膠圖像分析儀(EBOX CX5，Viber Lourmat公司，法國)。

2 方法

2.1 動物分組及模型制備

大鼠適應性喂養1周后，隨機分為假手術組、模型組、蔥白提取物組和辛伐他汀組,每組10只。大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液(3 mL/kg)麻醉，仰位固定，備皮后酒精消毒,頸部正中切口，分離右側頸總動脈，結扎其遠心端，向心臟方向插入1.5 F球囊，進入4 cm后，向球囊內注水使球囊充盈后回拉約2～3 cm，反復3次，使內皮充分剝脫，完成后拔出球囊，結扎近心端血管，縫合切口。假手術組只進行手術操作，但不插入球囊損傷，其他操作同各實驗組。術后腹腔注射青霉素3天預防感染。假手術組正常飲水，模型組及各治療組給予高脂飼料(10%豬油、4%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶加入85.3%的全價基礎飼料)，并于手術后第3天于右下肢肌肉注射維生素D3針劑(3萬U/kg)。

2.2 給藥方法

造模后第1天起開始給藥，假手術組和模型組灌胃等量蒸餾水(10 mL/kg)，中藥組大鼠給予蔥白提取物1 mg/kg灌胃，西藥組給予辛伐他汀混懸液100 mg/kg灌胃，連續8周。

2.3 標本取材與制備

實驗第12周，各組動物禁食過夜后麻醉動物，腹主動脈取血分離血清，保存在-80 ℃低溫冰箱備用。打開胸腔，在主動脈弓起始段剪取1 cm主動脈標本，10%多聚甲醛溶液固定12 h。另取3 cm胸主動脈標本，去除脂肪組織，生理鹽水沖洗后置于-80 ℃低溫冰箱中凍存。

2.4 血脂水平檢測

采用全自動生化分析儀，分析血清標本，檢測血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)和高密度脂蛋白(HDL-C)。

2.5 主動脈脂質沉積情況觀察

將固定的胸主動脈標本用蒸餾水沖洗后，用油紅O脂肪染色法，分析組織切片中的中性甘油三酯、脂質以及脂蛋白等脂質狀況。

2.6 Bcl-2、PPARγ蛋白表達的檢測

將凍存備用的標本取出提取組織總蛋白,并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉移至PVDF膜上,用 5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h, 分別加入對應一抗,4 ℃搖床孵育過夜, 次日棄去一抗, 洗滌后加入山羊兔二抗，室溫孵育1 h, 洗滌后滴加HRP化學發光底物，孵育5 min,用計算機圖形分析軟件(Uvpgr32掃描，Gelw4d分析)自動分析圖形的大小和灰度。

2.7 統計學處理

3 結果

3.1 各組大鼠血脂水平比較

結果如表1所示，與假手術組比較，模型組血清TC、TG、LDL-C的濃度明顯升高，而HDL-C濃度則顯著降低，兩者比較差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，蔥白提取物組能夠降低血清TC、TG、LDL-C濃度水平而升高血清中HDL-C的濃度，同時陽性對照組與蔥白提取物組結果一致，也能顯著改善血清血脂代謝水平，兩組與模型組比較具有顯著性差異(P<0.05)。蔥白提取物組與辛代他汀組之間未見顯著性差異(P>0.05)。

表1 蔥白提取物對大鼠血脂水平的影響

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

3.2 病理組織學檢測

如圖1所示，與假手術組比較，模型大鼠胸主動脈血管壁有大量的脂質沉積，血管壁脂肪含量顯著增加。和模型組比較，蔥白提取物組和辛伐他汀組血管壁中脂質沉積顯著減少，其中蔥白提取物組減少更顯著。

注:A.假手術組；B.模型組；C.辛伐他汀組；D.蔥白提取物組。圖1 各組大鼠血管壁檢查(油紅染色，×400)

3.3 蔥白提取物對Bcl-2、PPARγ蛋白表達的影響

結果如表2、圖2所示，模型組胸主動脈組織中Bcl-2、PPARγ蛋白表達水平均顯著低于假手術組(P<0.05),而蔥白提取物組和辛伐他汀組能夠上調Bcl-2、PPARγ蛋白表達水平(P<0.05)，蔥白提取物組和辛伐他汀組之間比較差異無統計學意義 (P>0.05)。

表2 蔥白提取物對大鼠Bcl-2、PPARγ表達的比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

圖2 各組大鼠主動脈Bcl-2、PPARγ蛋白表達水平

4 討論

中醫學中沒有動脈粥樣硬化(AS)的病名，根據其臨床表現，可歸屬于“胸痹”的范疇。中醫學認為,胸痹病因多樣，病機復雜，漢代張仲景提出其病機為“陽微陰弦”,“陽微”即本質屬陽氣不足，血行不暢，“陰弦”即痰濁、瘀血等病理產物為患。AS過程中斑塊形成多與脂質代謝異常相關，屬于中醫學“痰濁”范疇，而“辛溫通陽”是治療胸痹的根本方法，陽氣一通，痰瘀得散，則心痛可除。蔥白作為辛溫通陽的代表中藥，《本草綱目》言：“卒心急痛，牙關緊閉欲絕，以老蔥白五莖去皮須，搗膏，以匙送入咽中，灌以麻油四兩，但得下咽即蘇。”指出單用蔥白一味即可治療胸痹，緩解心痛?！侗静萁浖ⅰ芬灿涊d：“蔥白以升陽，云通者，一以溫之而令陽氣得入，一以發之而令陰氣易散也?！?/p>

在AS形成的過程中，血脂水平異常對于AS發展以及心血管病發生有重要的預測意義。臨床最常見的TC、TG、LDL-C和HDL-C血脂指標在AS斑塊的形成及進展中較為關鍵。LDL-C水平可以加速AS的發展，LDL-C作為TC的主要載體，血清中升高的LDL-C經過氧化后形成氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)，會促進AS的發生[3-4]。而HDL-C可以影響膽固醇逆轉運、改善內皮細胞功能、抗炎、抗血栓和促纖溶等多途徑共同發揮抗AS的作用[5-6]。TC自身在血液循環中極易沉積在動脈壁上，并隨著動脈壁細胞增生和纖維細胞堆積形成粥樣硬化斑塊[7]。從本實驗結果可以發現，AS大鼠的血脂水平出現明顯異常，表現為血清中TC、TG、LDL-C的濃度明顯升高，而HDL-C濃度則顯著降低，同時油紅O染色發現AS大鼠胸主動脈血管壁有大量的脂質沉積，血管壁脂肪含量顯著增加。而蔥白提取物可以改善AS大鼠血脂水平，降低TC、TG、LDL-C的濃度而升高HDL-C濃度，同時減少血管壁脂質沉積，說明辛溫通陽中藥蔥白可以調節脂質代謝，減少內膜脂質的形成, 起到抑制AS形成的作用。

Bcl-2作為一種細胞因子，主要參與細胞凋亡的線粒體途徑，其表達增加可引起細胞增殖，表達下調則導致凋亡[8]。研究表明,在AS斑塊中，Bcl-2參與血管平滑肌細胞、血管內皮細胞和巨噬細胞的凋亡過程，特別是對巨噬細胞的細胞凋亡發揮重要作用[9-10]。而過氧化物酶體增殖物激活受體 (PPARγ) 近年來也被發現與AS發生密切相關，主要表現在血管炎癥反應和影響血管硬化的病理過程，主要通過調控脂肪細胞分化和脂質代謝, 調控糖穩態及胰島素敏感性以及抗炎、抗增殖活性來發揮作用[11-12]。本研究發現，AS大鼠胸主動脈組織中Bcl-2、PPARγ蛋白表達水平是明顯降低的，而通過蔥白提取物干預后，AS大鼠Bcl-2、PPARγ蛋白表達水平明顯升高，與陽性對照組辛伐他丁的作用結果一致，說明蔥白提取物調節脂代謝，改善AS進展水平可能與調控Bcl-2、PPARγ蛋白表達水平有關。但蔥白提取物發揮作用的具體機制仍未明確，這將是實驗團隊下一步的研究目標。