鵪鶉ESR1基因外顯子1多態(tài)性與早期生長性能的關聯(lián)分析

曹 恒，楊 帥，白俊艷，樊紅燈，龐有志，付學言，盧小寧，時坤鵬

(河南科技大學 動物科技學院，河南 洛陽 471023)

鵪鶉是一種古老的鳥類，在全球各地分布十分廣泛，品種繁多[1]。鵪鶉的肉和蛋具有豐富的營養(yǎng)價值[2]，相較于烏雞蛋和普通雞蛋，鵪鶉蛋蛋白質(zhì)含量最高，且磷脂含量也較高[3]，故有卵中佳品的美稱[4]。由于影響鵪鶉生產(chǎn)性能和繁殖性能的因素很多，且其遺傳力低[5]，通過常規(guī)選育進展較為緩慢。近年來，分子標記遺傳育種的研究正蓬勃發(fā)展，成為了品種選育與改良的一大新興技術。TSUDZUKI[6]對鵪鶉毛色、喙形、腳趾形態(tài)及蛋殼顏色等形態(tài)標記進行了研究。付晶等[7]篩選出能夠準確鑒別鵪鶉性別的CHD基因標記;白俊艷等[8]和吳勝軍等[9]利用微衛(wèi)星標記分析了鵪鶉群體的多態(tài)性;王旭等[10]利用生物信息學方法分析了鵪鶉的EST-SSR多態(tài)性。雌激素受體基因(Estrogen receptor gene，ESR)，在1962年由JENSEN等[11]發(fā)現(xiàn)，其影響雌性動物的第二性征、繁殖周期、生殖力、妊娠維持等，影響胚胎發(fā)育和系統(tǒng)分化。通常情況下，雌激素受體有2種亞型，即ESRα和ESRβ， 分別由不同的基因編碼，介導雌激素的多項效應。作為畜禽繁殖過程中的一個重要影響因子，ESR1(ESRα)基因在子宮和乳腺中起主導作用[12]。眾多學者已經(jīng)開展雌激素受體在人類、豬、雞、牛、綿羊、豚鼠等動物上的研究工作[13-15]，但是ESR1基因與鵪鶉生長發(fā)育性能的關聯(lián)分析未見報道，為此，以3個蛋用鵪鶉品種為受試對象，利用PCR-RFLP技術，分析ESR1基因外顯子1與鵪鶉早期生長性能的關聯(lián)性，以期為鵪鶉的標記選擇提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 血液采集及基因組DNA提取 供試動物為北京白羽鵪鶉50羽、中國黃羽鵪鶉50羽、朝鮮鵪鶉50羽，采用心臟采血法進行采血，將血液儲存在含有EDTA抗凝劑的真空采血管中，放至-20 ℃的冰箱進行冷凍保存以備使用。采用試劑盒法提取鵪鶉的基因組DNA，家禽全血基因組DNA提取試劑盒由鄭州鼎國生物技術有限公司提供。

1.1.2ESR1基因外顯子1引物合成ESR1基因外顯子1引物序列參考蒲躍進[16]方法設計， 由北京鼎國昌盛生物技術有限公司合成，引物序列:F:CAAAGCCTCTGGAGTTAC，R:AGCAGTTTCCCTCAT-

CCC，預期擴增片段大小為370 bp。

1.2 試驗方法

1.2.1ESR1基因外顯子1的PCR擴增 反應體系共15 μL：上游引物0.6 μL，下游引物0.6 μL，DNA1.0 μL，2×TaqPCR Mix 7.5 μL，ddH2O 5.3 μL。PCR反應循環(huán)參數(shù)：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性40 s，55.4 ℃退火45 s，72 ℃延伸35 s，35個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。

1.2.2ESR1基因外顯子1的PCR-RFLP檢測ESR1引物擴增的PCR產(chǎn)物進行的酶切反應體系為15 μL：ddH2O 5 μL，PCR產(chǎn)物8 μL，限制性內(nèi)切酶PvuⅡ(10 U/μL) 0.5 μL，10×Buffer 1.5 μL?；旌暇鶆蚝笾糜?7 ℃水浴消化4 h。酶切產(chǎn)物使用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，額定電壓100 V，額定電流100 mA。電泳結束后使用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照，并記錄每個個體的基因型。

1.2.3ESR1基因外顯子1的多態(tài)性與鵪鶉早期生長性能的關聯(lián)分析 關聯(lián)分析模型：yijk=μ+Bi+Mj+eijk,式中yijk為性狀表型值，μ為總體均值，Bi為第i個品種效應(i=1，2，3)，Mj為第j種基因型效應，eijk為殘差效應。

2 結果與分析

2.1 ESR1基因外顯子1的PCR擴增產(chǎn)物檢測

ESR1基因外顯子1在3個鵪鶉群體中的PCR擴增產(chǎn)物檢測結果見圖1。從圖1可以看出，檢測結果為唯一的明亮條帶，無雜帶和脫尾現(xiàn)象，片段大小約為370 bp。

M.DL2000 Marker; 1—2.中國黃羽鵪鶉;3—4.北京白羽鵪鶉; 5.朝鮮鵪鶉

2.2 ESR1基因外顯子1的多態(tài)性檢測

圖2是ESR1基因外顯子1多態(tài)性在3個鵪鶉群體中的部分檢測結果。從圖2可以看出，ESR1基因外顯子1在鵪鶉群體中能檢測到3種基因型，即為TT基因型(370 bp)、CC基因型(330 bp/40 bp)和CT基因型(370 bp/330 bp/40 bp)。

M.DL2000 Marker; (A).中國黃羽鵪鶉; (B).北京白羽鵪鶉; (C).朝鮮鵪鶉;3、8為TT基因型;1、2、11、12、13、14、18為CC基因型;4、5、6、7、9、10、15、16、17為CT基因型

2.3 ESR1基因外顯子1的測序分析

將鵪鶉ESR1基因外顯子1的CC、CT、TT這3種基因型的PCR擴增產(chǎn)物進行序列測定，結果顯示，在312 bp出現(xiàn)C/T突變，95 bp出現(xiàn)C/T突變，圖3是95 bp處的C/T突變結果。

圖3 ESR1基因外顯子1的不同基因型測序結果Fig.3 Sequencing results of different genotypes of exon 1 of ESR1 gene

2.4 ESR1基因外顯子1的基因頻率和基因型頻率

ESR1基因外顯子1在3個蛋用鵪鶉群體中的基因型頻率和基因頻率等多態(tài)信息結果見表1。從表1可以看出，ESR1基因外顯子1在中國黃羽鵪鶉、北京白羽鵪鶉、朝鮮鵪鶉中都以CC基因型頻率為最高，CC基因型頻率分別為0.515、0.600、0.723，ESR1基因外顯子1在3個蛋用鵪鶉群體中C等位基因為優(yōu)勢等位基因。中國黃羽鵪鶉的遺傳多樣性相對較大[雜合度(He)為0.409]，北京白羽鵪鶉、朝鮮鵪鶉的遺傳多樣性較小。ESR1基因外顯子1在朝鮮鵪鶉群體中為低度多態(tài)[多態(tài)信息含量(PIC)<0.25]，在中國黃羽鵪鶉和北京白羽鵪鶉群體為中度多態(tài)(0.25

表1 ESR1基因外顯子1的遺傳多態(tài)性Tab.1 Genetic polymorphism of exon 1 of ESR1 gene

2.5 ESR1基因外顯子1的多態(tài)性與鵪鶉早期生長性能的關聯(lián)性分析

由表2可以看出，3周齡時，朝鮮鵪鶉的CT基因型的脛長、胸骨長、體長顯著高于CC基因型(P<0.05)；5周齡時，朝鮮鵪鶉的CT基因型的胸骨長和脛圍顯著性高于CC基因型(P<0.05)?？梢?，ESR1基因外顯子1與朝鮮鵪鶉的脛長、胸骨長、體長、脛圍有相關性(P<0.05)。

5周齡時，北京白羽鵪鶉的TT基因型體質(zhì)量顯著性高于CC基因型(P<0.05)?？梢姡珽SR1基因外顯子1與北京白羽鵪鶉的體質(zhì)量有相關性(P<0.05)。

5周齡時，中國黃羽鵪鶉的CC基因型的體質(zhì)量、胸深、胸骨長顯著高于TT基因型(P<0.05)。7周齡時，中國黃羽鵪鶉CC基因型的體質(zhì)量、脛長、胸深、體長顯著高于TT基因型(P<0.05)。可見，ESR1基因外顯子1與中國黃羽鵪鶉的體質(zhì)量、脛長、胸深、體長、胸骨長有相關性(P<0.05)。

表2 ESR1基因外顯子1的多態(tài)性與鵪鶉早期生長性能的關聯(lián)分析Tab.2 Association of ESR1 gene exon 1 polymorphism with early growth performance in quails

注：同周齡同列數(shù)據(jù)上標不同小寫英文字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters at the same week in the same column mean the significant difference(P<0.05).

3 結論與討論

在對家禽ESR基因多態(tài)性的研究上，季華員等[17]研究了ESR1基因在東鄉(xiāng)綠殼蛋雞群體中的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)在外顯子1有5個突變位點，外顯子4和8各有1個突變位點。王洪才等[18]研究了莊河大骨雞ESR基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)了CC、CD、DD基因型。周瑩瑩等[19]對蛋用黑羽鵪鶉ESR基因外顯子的多態(tài)性進行了分析，結果表明,ESR基因外顯子1、3、4、6、8中均存在多態(tài)性。本研究在3個鵪鶉品種的ESR1基因外顯子1上共發(fā)現(xiàn)了2個突變位點，分別為C95T位點和C312T位點，檢測到3種基因型(TT、CC和CT)，這與蒲躍進[16]的研究結果相同。3個鵪鶉品種的等位基因C的頻率均在0.7以上，為優(yōu)勢等位基因，這一結果與周瑩瑩等[19]的結果相同。ESR1基因外顯子1在3個鵪鶉品種中都有著較小的遺傳多樣性(He<0.5)。朝鮮鵪鶉群體為低度多態(tài)(PIC<0.25)，中國黃羽鵪鶉和北京白羽鵪鶉群體為中度多態(tài)(0.25

畜禽的繁殖性能(產(chǎn)蛋數(shù)和產(chǎn)仔數(shù))是畜禽重要的經(jīng)濟性狀，對于母畜來說一般也將其繁殖性能作為目標性狀進行選種。家禽體內(nèi)的雌激素具有控制排卵期卵泡的生長及卵黃的生成、參與蛋殼形成及產(chǎn)卵活動、刺激雞輸卵管發(fā)育等功能。ESR基因作為雌激素發(fā)揮作用的重要因子，同樣參與了雌激素作用的生理過程。因此，國內(nèi)外對ESR基因的研究主要集中在與畜禽繁殖性能的關聯(lián)上，于吉英等[20]研究表明，ESR基因的多態(tài)性與300日齡文昌雞產(chǎn)蛋數(shù)存在顯著性相關(P<0.05)。王文濤等[21]研究發(fā)現(xiàn)，ESR基因?qū)η瓥|南小香雞的產(chǎn)蛋性狀具有顯著性的影響(P<0.05)。王洪才等[18]研究發(fā)現(xiàn)，莊河大骨雞ESR基因多態(tài)性與產(chǎn)蛋數(shù)、蛋料比存在關聯(lián)性(P<0.05)。周瑩瑩等[19]研究發(fā)現(xiàn)，ESR基因外顯子1與蛋用黑羽鵪鶉的開產(chǎn)日齡存在顯著的相關性(P<0.05)。蒲躍進[16]研究發(fā)現(xiàn)，ESR基因外顯子1與鵪鶉的開產(chǎn)日齡存在顯著的相關性(P<0.05)。曹晶晶[22]研究表明，ESR基因影響蘇太豬的產(chǎn)仔數(shù)和初生窩質(zhì)量(P<0.05)。胡閃耀[23]研究表明，ESR基因影響大白豬的總產(chǎn)仔數(shù)和初生窩質(zhì)量(P<0.05)。

對于ESR基因與早期生長性能的研究并不多，王宵燕等[24]研究發(fā)現(xiàn)，蘇姜豬的ESR基因的AA基因型體長顯著高于BB基因型(P<0.05)，且體高、胸圍、體質(zhì)量極顯著高于BB基因型(P<0.01)。劉衛(wèi)東[25]研究表明，ESR基因?qū)M系大白豬和皖系大白豬的日增質(zhì)量有顯著影響(P<0.05)，而對體高、體長、胸圍無顯著影響。李隱俠[26]研究發(fā)現(xiàn)，在蘇淮豬群體中ESR基因的各基因型對早期生長性能的影響無顯著差異(P>0.05)。可見，ESR基因?qū)Σ煌贩N豬早期生長性能的影響也是不同的。本研究發(fā)現(xiàn)，ESR1基因外顯子1與朝鮮鵪鶉的脛長、胸骨長、體長、脛圍有相關性(P<0.05)，與北京白羽鵪鶉的體質(zhì)量有相關性(P<0.05)，與中國黃羽鵪鶉的體質(zhì)量、脛長、胸深、體長、胸骨長有相關性(P<0.05)?？梢姡珽SR1基因外顯子1在不同鵪鶉品種中對早期生長性能的影響也不同。朝鮮鵪鶉、北京白羽鵪鶉和中國黃羽鵪鶉是蛋用鵪鶉，在選種時首先考慮其產(chǎn)蛋數(shù)這一繁殖性能外，還要兼顧其體質(zhì)量、體長、胸骨長等生長性能。因此，ESR1基因外顯子1可作為候選基因應用于蛋用鵪鶉早期生長性能的分子標記輔助選擇。