氰氟草酯對泥鰍的毒性效應

尚泰宇，時春雨，秦朝輝，彭夢圓，賈博爽，夏曉華

(河南師范大學 生命科學學院，河南 新鄉 453007)

稻田養魚亦即嵌套養殖，是一種人工稻魚共存的生態產業結構[1]。該農業生產模式將養殖業與種植業結合起來，因其高效便捷、經濟雙收等特點受到越來越多養殖戶的青睞。小型淡水魚類泥鰍(Misgurnusanguillicadatus)隸屬鯉形目、鰍科、泥鰍屬。其食性較廣，是稻田生態漁業的優良養殖品種。同時，其具有環境適應力強、耐受性強等特點，是理想的水生生物試驗材料。

氰氟草酯(Cyhalofop-butyl)作為一種對水稻具有高度安全性的芳氧苯氧丙酸類除草劑，在田間主要用于防除千金子等惡性禾本科雜草，近年來在農業生產中的使用呈逐步上升趨勢[2]。農業生產中化學除草劑的不合理使用，易導致其通過地表徑流、污水排放等方式流入河流、湖泊等水生生態系統，通過食物鏈富集，進一步對水生生物的生存及人體健康構成威脅。近年來，已有關于氰氟草酯對兩棲類生物毒性分級、斑馬魚胚胎發育等水生生物影響的報道。吳長興等[3]研究了氰氟草酯對澤蛙蝌蚪的急性毒性，結果顯示，其對澤蛙蝌蚪的24 h半數致死質量濃度(LC50)和48 h LC50分別為0.718 mg/L和0.677 mg/L，屬高毒級，田間施用應合理控制劑量；CAO等[4]研究了氰氟草酯對斑馬魚早期胚胎發育的毒性效應，結果表明，0.8 mg/L或更高質量濃度的氰氟草酯溶液對于早期胚胎發育具有更明顯的致死效應，同時氰氟草酯在斑馬魚胚胎發育的不同階段均產生較嚴重的負面影響。

目前，關于氰氟草酯對泥鰍的毒性研究尚未見報道。為此，以泥鰍為受試對象，探究了氰氟草酯對泥鰍肝臟的急性毒性、生理毒性及組織形態學毒性，旨在為安全施用氰氟草酯、促進農業特色生產結構水稻-泥鰍嵌套養殖可持續發展、維護生態平衡提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 供試動物及試劑

泥鰍(Misgurnusanguillicadatus)采自新鄉市海鴻農貿市場，選擇發育狀況良好、體質量13～16 g、平均體長9～12 cm的健壯泥鰍500尾，試驗前用曝氣3 d的自來水馴養7 d，馴養期間死亡率小于2%。挑選健康、體表無損的個體作為試驗材料；試驗前進行饑餓處理，試驗期間不投食，采用曝氣2 d以上的自來水，水溫13～24 ℃，溶解氧5～6 mg/L，pH值6.8～7.3。氰氟草酯購自上海惠光化學有限公司(有效成分質量濃度100 g/L)。

1.2 試驗方法

1.2.1 氰氟草酯對泥鰍的急性毒性試驗 根據預試驗結果，等比設置5個試驗組和1個空白對照組進行急性毒性試驗，氰氟草酯質量濃度分別為6.00、6.30、6.62、6.95、7.29、0 mg/L，每組均投放健康泥鰍30尾，分為3個平行。每24 h更換一次等體積等質量濃度的氰氟草酯，試驗開始后12 h連續觀察，記錄泥鰍24、48、72、96 h的中毒癥狀和死亡數量，及時清除死亡個體。最后，采用改良寇氏法[5-6]計算氰氟草酯對泥鰍的半數致死質量濃度和安全質量濃度(SC)。

1.2.2 氰氟草酯對泥鰍抗氧化系統酶活性的影響測定 在急性毒性試驗的基礎上，按照氰氟草酯處理96 h對泥鰍LC50的1/10、1/5分別設置低質量濃度試驗組(0.662 4 mg/L)、高質量濃度試驗組(1.324 8 mg/L)及1個空白對照組(0 mg/L)，每組均投放44尾健康泥鰍，每天更換一次等體積等質量濃度的氰氟草酯。分別于第1、3、5、7天從每組隨機取5尾泥鰍，取其肝臟，在試驗過程中，首先稱量泥鰍肝臟的質量，然后以1∶9的比例加入0.8%生理鹽水進行研磨直至無明顯的組織塊，SOD、CAT、GSH-Px活性的測定均按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書進行，采用BCA法測定泥鰍肝臟蛋白質含量。

1.2.3 氰氟草酯對泥鰍抗氧化系統相關基因表達的影響測定 處理組和取材天數同上，從每組隨機取3尾泥鰍，取其肝臟保存于液氮。首先進行總RNA的提取，1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗總RNA完整性，超微量分光光度計檢測RNA的純度和質量濃度。使用全氏金RNA提取試劑盒構建20 μL反轉錄體系，其中包括Anchored Oligo(dT)181 μL、2×ES Reaction Mix 10 μL、EasyScript RT/R1 Enzyme Mix 1 μL、mRNA/總RNA 500 ng/μg，添加RNase-free Water至20 μL。反轉錄條件:42 ℃孵育30 min，85 ℃加熱5 s失活EasyScript RT/R1，4 ℃保溫，將RNA反轉錄成cDNA。取cDNA 0.5 μL為模板，相應基因正向和反向引物(表1)各0.2 μL，含有SYBR Green Ⅰ熒光染料、dNTPs、PCR增強劑、PCR穩定劑的混合物5 μL和ddH2O 4.1 μL構建10 μL實時熒光定量PCR(qPCR)反應體系，重復6組。qPCR擴增的參數如下：95 ℃預變性60 s；95 ℃變性15 s 和60 ℃復性60 s共進行45個循環；之后95 ℃ 10 s、65 ℃ 60 s、97 ℃ 1 s、37 ℃保溫30 s。測定出各個基因的Ct值，根據2-△△Ct法計算相關基因表達量。

表1 定量PCR引物信息

1.2.4 氰氟草酯對泥鰍的組織形態學毒性試驗 處理和取材時間同酶活性測定，從每組隨機取3尾泥鰍，取其肝臟進行石蠟切片HE染色。試驗前配制鉻礬明膠，清洗玻片，熬融石蠟。取泥鰍肝臟于4%多聚甲醛中固定24 h，流水沖洗后依次進行梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟試驗步驟，最后用牛皮盒紙進行包埋。完成包埋的組織依次進行切片、展片、烤片、二甲苯浸泡、梯度酒精復水處理，最后對石蠟切片進行蘇木精-伊紅染色，顯微鏡觀察其組織形態學變化。

1.3 數據處理

肝臟組織酶活性和基因表達試驗數據均采用Excel 2010軟件進行處理和分析，用SPSS 16.0軟件進行差異顯著性分析，P<0.05為差異達到顯著水平，P<0.01為差異達到極顯著水平。

2 結果與分析

2.1 氰氟草酯對泥鰍的急性毒性

泥鰍剛染毒時，表現為急劇游動、四處亂竄，片刻后稍趨于平靜，伏于水底。隨著氰氟草酯劑量的增加，可觀察到泥鰍反應遲鈍、身體彎曲、喪失平衡能力等現象，其死亡率不斷升高，死亡時身體僵直，脊椎略彎曲呈弓形。

由表2可知，氰氟草酯對泥鰍24、48、72、96 h的LC50分別為7.254 4、7.102 3、6.809 3、6.623 7 mg/L，SC為2.042 3 mg/L。在同一時間段內，泥鰍死亡率隨氰氟草酯質量濃度的升高而增加；在同一劑量組中，泥鰍死亡率隨暴露時間的延長而增加。可見，泥鰍的死亡率與氰氟草酯呈時間-劑量效應關系。

表2 氰氟草酯各質量濃度組泥鰍的死亡率、半數致死質量濃度和安全質量濃度

2.2 氰氟草酯對泥鰍肝臟SOD、CAT和GSH-Px活性的影響

由圖1可知，從相同質量濃度不同暴露時間來看，在低質量濃度組，泥鰍肝臟SOD活性在第3天升高后無顯著性變化(P>0.05)，高質量濃度組SOD活性在第5天下降后無顯著性變化(P>0.05)，且試驗組SOD活性均顯著高于對照組(P<0.05)。隨著染毒時間的延長，試驗組中CAT活性逐漸下降，且高質量濃度組較低質量濃度組變化更顯著。GSH-Px活性呈現先上升后下降的變化趨勢，低質量濃度組中GSH-Px活性在第5天達最大值，高質量濃度組中GSH-Px活性在第3天達最大值。

從相同暴露時間不同質量濃度組來看，在第1、3天，SOD活性隨氰氟草酯質量濃度的增大而升高，在第5、7天，SOD活性先升高后降低，處理組均顯著高于對照組(P<0.05)。在第1天，CAT活性隨氰氟草酯質量濃度的增大而升高，而在第3、5、7天均呈現先升高后降低的趨勢，至第7天時處理組與對照組無顯著差異。在第1、3天，GSH-Px活性隨氰氟草酯質量濃度的增大而升高，在第5、7天呈現先升高后降低的趨勢。

不同小寫字母表示同一劑量組不同暴露時間點之間存在顯著性差異(P<0.05)，不同大寫字母表示同一暴露時間點不同劑量組之間存在顯著性差異(P<0.05)，下同

2.3 氰氟草酯對泥鰍肝臟SOD、CAT、GSH-Px基因表達的影響

由圖2可知，從相同質量濃度不同暴露時間來看，在低質量濃度組中，SOD和CAT基因表達量隨暴露時間的延長而呈上升趨勢，GSH-Px基因表達量呈現先上升后下降趨勢。高質量濃度組中，SOD和CAT基因表達量隨暴露時間的延長呈現先上升后下降趨勢，GSH-Px基因表達量呈現下降趨勢。

從相同暴露時間不同質量濃度組來看，隨著氰氟草酯質量濃度的升高，在第1、3天，SOD基因表達量呈現逐漸下降趨勢，而在第5、7天呈現先上升后下降趨勢；在第1天，CAT基因表達量呈現先下降后上升趨勢，在第3、5、7天均呈先上升后下降趨勢；在第1天，GSH-Px基因表達量呈現逐漸上升趨勢，在第3、5、7天則呈現先上升后下降趨勢，同時在低質量濃度組及高質量濃度組的基因表達量均顯著高于對照組(P<0.05)。

圖2 不同質量濃度氰氟草酯處理泥鰍肝臟中SOD、CAT、GSH-Px基因表達變化Fig.2 Expression changes of SOD, CAT and GSH-Px genes in Misgurnus anguillicaudatus liver treated with cyhalofop-butyl at different concentrations

2.4 氰氟草酯對泥鰍肝臟組織形態的影響

由圖3可知，空白對照組(0 mg/L)中，泥鰍的肝臟細胞胞質均勻，細胞核均位于細胞中央，呈規則圓形或橢圓形，肝臟細胞形態規則且無明顯變化。在低質量濃度試驗組(0.662 4 mg/L)中，5 d時可見細胞間隙變大，7 d時可見細胞空泡化與細胞腫大現象。在高質量濃度試驗組(1.324 8 mg/L)中，1 d時即可見肝臟細胞空泡化、細胞間隙增大現象，隨著染毒時間的延長，細胞腫大、空泡化情況嚴重；7 d時肝臟細胞排列彌散，出現大量肝臟細胞空泡，同時伴有細胞溶解及核變形現象，核固縮情況嚴重。結果表明，隨染毒天數和試驗組質量濃度的增加，氰氟草酯對泥鰍肝臟組織損傷程度加深。

CS:細胞間隙;CV:細胞空泡;CE:細胞腫大;CP:細胞核固縮

3 結論與討論

3.1 氰氟草酯的毒性分類

根據中國《化學農藥環境安全評價試驗準則》，當農藥對魚類1.0 mg/L<96 h LC50≤10 mg/L時，該農藥屬中毒[7]。由試驗結果可知，氰氟草酯對泥鰍的96 h LC50為6.623 7 mg/L，說明氰氟草酯對泥鰍屬于中毒。同時隨著染毒時間的延長，泥鰍死亡率逐漸升高，表明氰氟草酯對水生生物有毒害作用。因此，在使用該除草劑時應注意合理使用，避免污染水源、破壞環境，以免對水生生物造成危害。

3.2 氰氟草酯對泥鰍肝臟抗氧化系統的影響

生物體肝臟在代謝有毒物質時會產生大量的活性氧，如超氧自由基、過氧化氫等。這些活性氧會破壞生物體內的蛋白質、DNA堿基、脂膜等物質，從而造成生物體的損傷甚至死亡。抗氧化酶系統的主要作用是平衡生物體內活性氧，避免其對生物體的氧化損傷[8]。已有研究表明，SOD、CAT、GSH-Px是生物防御體系的關鍵酶[9]。SOD能將生物體內過多的超氧陰離子轉化為H2O2和H2O，降低其毒性[10]。CAT能催化H2O2分解成H2O和O2，從而使細胞免受H2O2的毒害。GSH-Px能特異性催化GSH對脂質氫過氧化物的還原作用，保護細胞免受氧化損傷。由于抗氧化酶對氧化脅迫敏感，故常作為研究機體是否處于氧化脅迫狀態的生物指標。

本試驗中，在氰氟草酯低質量濃度處理組中，泥鰍肝臟中SOD基因表達量呈上升趨勢，酶活性則呈先升高后降低趨勢；在高質量濃度處理組中，SOD基因表達量呈先上升后下降趨勢，酶活性呈降低趨勢，推測高質量濃度的氰氟草酯對SOD及其相關基因的影響呈先誘導后抑制作用。低質量濃度處理組中，CAT基因表達量呈上升趨勢；在高質量濃度處理組中，CAT基因表達量呈先上升后下降趨勢，可知高質量濃度組中，細胞受到氧化脅迫較為嚴重；在各質量濃度處理組中，CAT活性均呈下降趨勢，與張靜靜[11]有關甲氰菊酯對泥鰍肝臟CAT的毒性作用試驗結論一致。GSH-Px基因表達量及酶活性在低質量濃度組中均呈先升高后降低的趨勢，在高質量濃度組中，基因表達量呈下降趨勢，酶活性呈先升高后降低趨勢，推測氰氟草酯對GSH-Px基因的影響也呈先誘導后抑制作用。由以上結果推測，低質量濃度的氰氟草酯能夠在短時間內對泥鰍抗氧化酶系統的表達起誘導作用，這有助于機體快速代謝有毒物質；而隨著暴露時間的延長和氰氟草酯劑量的增加，泥鰍肝臟組織發生病變，抗氧化酶系統持續受損，進一步導致酶活及相關基因表達受到抑制。

3.3 氰氟草酯對泥鰍肝臟組織的損傷

魚類肝臟組織細胞的結構變化通常可以作為環境中有毒污染物的生物指標[12]。研究報道，當魚類暴露于污染物中，會誘導產生肝臟細胞核裸露、胞質空泡化現象，同時伴隨肝臟巨噬細胞增多、肝臟竇間隙增大等現象[13]。由于竇間隙的增大，肝臟細胞與血液間物質交換發生變化，造成大量液體滯留而導致肝臟組織易發生水腫[14-15]。在本試驗中，低質量濃度氰氟草酯處理泥鰍第5天時可見肝臟竇間隙變大，第7天時開始出現肝臟細胞空泡化及肝臟組織水腫現象，與之前研究報道相一致。高質量濃度組中第7天可觀察到肝臟細胞空泡化、細胞腫大情況十分嚴重，并伴有核固縮現象，推測DNA停止轉錄，這是細胞凋亡的典型形態特征之一[16]，說明氰氟草酯不僅使泥鰍的肝臟組織結構發生變化，還會導致肝臟細胞凋亡。

氰氟草酯對泥鰍有一定的急性毒性、生理毒性和組織損傷作用，因此在稻田施用時一定要控制其用量，防止水體污染，以減少對生態環境和稻田中的水生生物的危害，避免造成農戶經濟損失。合理施用農藥是農業生產中的關鍵，對環境保護和農業的可持續發展具有重要的指導意義。