一漢族念珠狀發(fā)家系調(diào)查和Ⅱ型毛發(fā)角蛋白基因突變分析

王霞 楊閣 李凌 魏榮芳 熊春萍

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科510120；2梅州市人民醫(yī)院皮膚科，廣東梅州514023

念珠狀發(fā)（monilethrix，OMIM：158000）是一種罕見的毛干結(jié)構(gòu)異常的遺傳性疾病［1］，1879年由Smith首次描述。該病多數(shù)為常染色體顯性遺傳，偶有呈常染色體隱性遺傳的病例報道［2-3］。臨床以毛干間斷性規(guī)則或不規(guī)則縮窄進(jìn)而形成念珠狀毛發(fā)為特征，縮窄部易折斷，頭發(fā)呈局限性或彌漫性稀疏，短、干枯、無光澤，重者累及全身毛發(fā)，常伴毛囊角化性丘疹［4-5］。目前，國外學(xué)者認(rèn)為該病的發(fā)生與毛發(fā)角蛋白基因突變可能有關(guān)［6］。然而，國內(nèi)學(xué)者對念珠狀發(fā)的研究較少，對該病的致病突變尚未明確。我們收集到一個中國廣東籍漢族念珠狀發(fā)家系，發(fā)現(xiàn)3代15人中存在4例念珠狀發(fā)患者，我們對該家系成員進(jìn)行分子遺傳學(xué)研究，以期發(fā)現(xiàn)致病突變，為該病的診斷提供更多的理論依據(jù)。

一、資料與方法

1.臨床資料：先證者女，8歲，廣東省人，漢族，因毛發(fā)稀少7年余來廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院脫發(fā)專科就診。出生時頭發(fā)無明顯異常，在約2個月后，部分頭發(fā)開始變得脆弱易折斷，干燥而無光澤，容易拔出。頭發(fā)稀疏，以枕部尤甚，冬季加重，春季緩解，無自覺癥狀。父母非近親結(jié)婚，母親妊娠期無特殊疾病和服藥史，足月順產(chǎn)。皮膚科檢查：頭部毛發(fā)彌漫性稀疏（圖1A），多數(shù)為2 cm斷發(fā)，外觀異常，肉眼可見頭部散在串珠狀發(fā)，以枕部為多，項部見毛囊角化性丘疹，眉毛、睫毛正常。指趾甲正常。皮膚鏡檢查：右顳部毛發(fā)發(fā)生典型的念珠狀改變，枕部較多毛發(fā)亦呈念珠狀改變，散在少數(shù)斷發(fā)，丘疹上見小黑點(diǎn)狀斷發(fā)（圖2A）。光鏡下病發(fā)膨大與縮窄交替出現(xiàn)，呈典型的規(guī)則串珠狀改變（圖2B）；掃描電鏡檢查示病發(fā)膨大部可見疊瓦狀毛小皮，毛小皮基本正常（圖2C），病發(fā)縮窄部可見大量毛小皮破壞、斷裂、消失，并見明顯的縱嵴、縱溝（圖2D）。給予患兒2%米諾地爾溶液連續(xù)外搽9個月，毛發(fā)變密且明顯變長（圖1B），皮膚鏡檢查仍見念珠狀發(fā)，但較先前減少。

圖1 念珠狀發(fā)先證者臨床表現(xiàn)

圖2 念珠狀發(fā)患者毛發(fā)皮膚鏡、光鏡和掃描電鏡下圖像

調(diào)查顯示，該家系3代共15人，對家系中毛發(fā)異常的成員同時進(jìn)行皮膚鏡、光鏡和掃描電鏡檢查，發(fā)現(xiàn)4例患者（男2例，女2例，包括患兒）毛發(fā)存在典型的念珠狀改變，符合念珠狀發(fā)的初步診斷。該家系中男女均患病，呈垂直傳遞現(xiàn)象（圖3），符合常染色體顯性遺傳模式特征。本研究經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（醫(yī)研倫審2019第K-04號），受試者均簽署知情同意書。

圖3 念珠狀發(fā)家系圖

2.DNA提取：抽取患者、14名家系成員和100例健康對照靜脈血各5 ml，2%乙二胺四乙酸抗凝，-80℃凍存。采用全血基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取外周血DNA。

3.PCR擴(kuò)增：參考以往研究結(jié)果，念珠狀發(fā)突變位點(diǎn)集中在Ⅱ型毛發(fā)角蛋白1（hHb1）、hHb3和hHb6外顯子1和7上，因此采用Primer 5.0引物設(shè)計軟件針對hHb1、hHb3和hHb6外顯子1和7設(shè)計引物，擴(kuò)增目標(biāo)序列及超出目標(biāo)序列邊界（內(nèi)含子內(nèi)）50 bp的序列，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成（表1）。

PCR反應(yīng)體系為50μl，其中反應(yīng)液包括5μl緩沖液、0.5μl 10 mmol/L dNTP、上下游引物各0.5μl、Taq酶0.5μl、25 mmol/L MgCl25μl、二甲基亞砜1.5μl、DNA模板10μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性1.5 min，94℃30 s，62℃30 s，72℃60 s，共35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。將PCR產(chǎn)物送至廣州基地奧生物科技有限公司測序，將結(jié)果與NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫目標(biāo)基因序列進(jìn)行比對，分析突變位點(diǎn)。

表1 hHb1、hHb3和hHb6基因外顯子1和7的引物序列

二、結(jié)果

電泳檢測顯示在患者、家系成員和對照組樣本中均擴(kuò)增出hHb1、hHb3和hHb6基因外顯子1和7序列，其中hHB6基因外顯子7擴(kuò)增條帶長465 bp。

測序結(jié)果顯示，患者及其他家系成員和對照組的hHb1、hHb3外顯子1和7及hHb6外顯子1均未見突變。先證者及家系中其他3例患者在hHB6基因外顯子7第1 237位堿基處均存在雜合突變（G＞A），導(dǎo)致編碼氨基酸的密碼子由CGA突變?yōu)镃AA（谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔碋413K），而家系健康成員及100例健康對照未檢測到該突變，測序結(jié)果見圖4。

圖4 念珠狀發(fā)患者及健康對照hHB6基因第7外顯子PCR產(chǎn)物測序圖

三、討論

念珠狀發(fā)具有較高的外顯率和不同的臨床表現(xiàn)［7］。自1997年Winter等［8］發(fā)現(xiàn)第一個念珠狀發(fā)hHb致病突變至今，共發(fā)現(xiàn)10種hHb點(diǎn)突變與念珠狀發(fā)相關(guān)［9-10］。這些突變?nèi)堪l(fā)生于Ⅱ型毛發(fā)角蛋白hHbl、hHb3和hHb6基因。目前，國內(nèi)在念珠狀發(fā)患者中發(fā)現(xiàn)兩種雜合突變，分別為hHb6基因E402K和R430Q［11-13］。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)一念珠狀發(fā)家系中4例患者h(yuǎn)Hb6基因外顯子7第1 237位堿基存在G＞A轉(zhuǎn)變，即E413K。在PubMed、中國知網(wǎng)和萬方醫(yī)學(xué)等數(shù)據(jù)庫中以“念珠狀發(fā)、hHb、基因和突變”等為關(guān)鍵詞檢索，國內(nèi)未發(fā)現(xiàn)hHb6基因E413K突變位點(diǎn)的報道，但該突變在國外報道中是念珠狀發(fā)的一個突變熱點(diǎn)［14］。hHb6位于毛發(fā)角蛋白的2B區(qū)，該區(qū)域在角蛋白中間絲裝配中起重要作用。分子動力學(xué)研究表明，谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼峥梢鹜蛔儏^(qū)域肽鏈構(gòu)象的顯著變化及原子/基團(tuán)間靜電相互作用力的改變，進(jìn)而影響角蛋白中間絲的裝配及穩(wěn)定性［15］，穩(wěn)定性發(fā)生改變的中間纖維絲會導(dǎo)致患者的頭發(fā)呈念珠狀［16］，因此該突變可能是導(dǎo)致本文家系患者念珠狀發(fā)的原因。

念珠狀發(fā)呈慢性病程，目前臨床上尚無確切有效的治療方法。近期有報道外用米諾地爾溶液以及口服阿維A類制劑治療有效［17］。考慮到先證者為女童，所以選擇2%米諾地爾溶液外搽，治療9個月后取得良好的效果，而停藥2年后隨訪毛發(fā)仍持續(xù)變密，推測可能是用藥期間米諾地爾溶液通過促進(jìn)毛發(fā)生長期的發(fā)育和擴(kuò)張頭皮血管促進(jìn)毛發(fā)生長，同時本病隨年齡增長有自行緩解趨勢，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突