PPAR-α激動劑WY14643對肝癌TAE術后癌旁肝組織氧化應激的作用

吳春華，王貝然，余義俊，周 舟，杜 偉

(大理大學第一附屬醫院/大理大學臨床醫學院放射科，云南大理 671000)

原發性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)是世界最常見的惡性腫瘤之一，致死率僅次于肺癌[1]。經導管肝動脈栓塞術(transcatheter arterial embolization，TAE)是治療PHC的主要方法[2-4]，可抑制局部腫瘤的生長，但TAE術后患者出現不同程度肝功能下降，是其不可避免的并發癥[5-6]。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPARs)是一類由配體激活的轉錄因子，屬于核激素受體超家族成員[7]。PPAR-α激動劑WY14643對包括肝臟在內的重要臟器的保護作用可能與PPARα激動劑具有抗氧化作用相關。本研究建立兔VX2肝癌TAE模型，通過觀察PPAR-α激動劑WY14643對肝癌TAE術后癌旁肝組織氧化應激損傷的作用情況，旨在分析WY14643在肝癌 TAE術后對肝功能的保護機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 荷瘤兔2只(由東南大學附屬中大醫院惠贈)，健康新西蘭大白兔30只[由昆明楚商科技有限公司提供，許可證號SCXK(滇)K2018-0001]，體質量2.5～3.5 kg，雌雄不限，普通飼料喂養。

1.1.2主要使用設備、實驗器材及藥品 PHILIPS 16排螺旋CT機，TOSHIBA TAITAN 3.0T磁共振機，GE INNOVA-3100IQ DSA，自制實驗兔手術臺，自制小洞巾，各型號注射器，3%戊巴比妥鈉，硫酸慶大霉素注射液,0.9%NaCl,超液態碘化油，明膠海綿顆粒350～560 μm(杭州艾力康醫藥科技有限公司提供),碘海醇，眼科剪，眼科鑷，培養皿，超凈臺，動脈夾，18G穿刺針，4F導管鞘，3FSP微導管。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)、過氧化氫酶 (catalase,CAT)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)試劑盒均購自南京建成生物試劑有限公司；WY14643(批號MKCF1249)購自美國Sigma公司。

1.2方法

1.2.1荷瘤兔傳代及VX2肝癌模型建立 隨機選取荷瘤種兔1只，2%戊巴比妥鈉(3 mg/kg)靜脈麻醉并固定，于后肢腫瘤處常規備皮、消毒，切入表皮，剝離腫塊,并將其周圍壞死組織剔除干凈，將瘤塊邊緣生長旺盛的魚肉樣腫瘤組織置于50 mL 0.9%NaCl和2萬U慶大霉素混合液的培養皿中，用眼科剪將瘤塊剪成1～3 mm的碎塊。用1 mL注射器抽吸瘤粒混合液(15～20個瘤粒/mL)后套用18G穿刺針送至健康兔后腿皮下，以保種傳代。將兔麻醉固定后，備皮、消毒并鋪巾，劍突下正中偏左側縱向切開腹部，暴露肝左葉，用眼科鑷將肝左葉完整拉出，1 mL注射器換用18 G穿刺針呈30°斜穿刺入肝左葉1.5～2.0 cm，回抽未見血液及膽汁回流后注入瘤粒混合液1 mL并迅速用明膠海綿填塞穿刺通道,防止瘤粒脫出，確保種植成功，腹腔內灑入慶大霉素40萬U，局部紗布壓迫止血3 min，檢查無滲血后回納肝臟，逐層縫合腹部切口，術后連續3 d肌內注射慶大霉素8萬U預防感染。

1.2.2實驗模型分組及處理 于接種后2周分別行CT及MRI掃描，確定肝癌瘤體在肝內的生長情況(圖1～2)，將建模成功的24只VX2肝癌兔進行隨機分組，其中對照組8只，TAE組8只，聯合治療組8只，TAE組只行TAE手術；聯合治療組注射WY14643 3 mg·kg-1·d-1，連續給藥3 d后行TAE術，對照組不做任何處理。

1.2.3TAE VX2肝癌模型兔全麻后固定于操作臺上，右腹股溝附近10 cm范圍內備皮、消毒后皮膚切一小口，用18G穿刺針穿刺進入股動脈后引入導絲，拔去穿刺針后引入4F導管鞘，經導管鞘放入4F導管，通過導絲選入腹腔干，然后將3F微導管通過4F導管超選入肝總動脈，造影明確腫瘤供血動脈，然后行超選擇性肝動脈造影，經3F微導管推入碘化油，劑量為每只荷瘤兔腫瘤直徑厘米數×0.2 mL，并依據腫瘤供血情況適當增減[8]，最后用明膠海綿顆粒栓塞，直至供血動脈血流緩慢停止(圖3)，術畢拔管并結扎肝動脈近端，處理切口。

A:平掃顯示肝實質內不均勻低密度病灶，腫瘤中心密度較低(紅箭)；B:增強顯示腫瘤實質及邊緣呈不均勻明顯強化，中心壞死區不強化(紅箭)

圖1肝臟CT掃描的影像表現

A：MRI T1WI軸位掃描顯示肝內不規則低信號改變(紅箭)；B:MRI T2WI軸位掃描顯示肝內不規則稍高信號改變(紅箭);C:MRI T2WI失狀位掃描

圖2肝臟MRI掃描的影像表現

A:腹腔干造影腫瘤血管推移呈“抱球征”；B:超選擇性插管推注碘油；C:TAE術后復查造影顯示腫瘤供血動脈血流中斷，血管閉塞；D:TAE術后平片見腫瘤區有碘油沉積

圖3腹腔干及肝動脈血管造影的影像表現

1.2.4實驗室檢查指標對肝功能的評價 分組處理后3 d，對3組實驗兔分別抽血檢測丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽紅素(TBI)、血清清蛋白(ALB)、凝血酶原時間(PT)，具體操作步驟按照說明書進行。

1.2.5肝組織SOD、GSH-PX、CAT和MPO的水平測定 3 d后將實驗動物處死，位于左上腹劍突下腹正中切口切取完整肝臟，分離瘤組織與周圍正常肝組織，距腫瘤大于2 cm處選取癌旁正常肝組織[8]，用生物酶學方法進行檢測，具體操作步驟按照說明書進行。

2 結 果

2.1肝癌模型建立成功率 成功建立兔肝癌模型24只，造模成功率為80.00%(24/30)。

2.2實驗室檢查肝功能各指標水平 術后3 d各組復查肝功能，TAE組肝功能明顯下降，與對照組差異有統計學意義比較(P<0.05)，聯合治療組與TAE組比較，ALT、AST、TBI降低，ALB升高，PT縮短，肝功能好轉差異均有統計學意義(P<0.05)；聯合治療組與對照組相關指標比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.3各組動物癌旁肝組織中SOD、GSH-PX、CAT和MPO水平比較 3組各指標用方差分析進行比較：與對照組比較，TAE組SOD、GSH-PX、CAT和MPO水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與TAE組比較，聯合治療組SOD、GSH-PX、CAT和MPO活力明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；聯合治療組與對照組相關指標比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表1 各組動物肝功能相關指標比較

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與TAE組比較

表2 各組動物癌旁肝組織SOD、GSH-PX、CAT和MPO水平比較

a：P<0.05,與對照組比較；b：P<0.05，與TAE組比較

3 討 論

近些年，PHC發病率逐年上升，大多數患者在確診時已經失去手術切除或肝移植的時機，僅有10%～20%有手術切除或肝移植的機會[9]。TAE可提供較好的局部區域腫瘤治療并延長患者的生存率，但即便用超選進行栓塞治療，栓塞劑不可避免地進入癌旁正常肝組織并沉積于微小動脈和毛細血管，導致組織缺血缺氧，最終不可避免地造成TAE術后肝功能下降[10-11]，影響患者的預后。

自由基過多會在機體內產生氧化應激反應，引起組織損傷，SOD、GSH-PX、CAT是生物體細胞內產生的天然自由基清除系統[12]，均屬于酶促抗氧化系統，其中SOD是最為關鍵的酶之一[13]，當肝臟缺血被阻斷再重新恢復血流供應后，會有大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)產生,它具有較活躍的化學性質，極易與肝細胞膜上的重要功能與結構蛋白發生過氧化反應，引發一系列復雜的內源性反應，導致肝細胞損傷[14]。另外，MPO是血紅素輔基的血紅素蛋白酶，是血紅素過氧化物酶超家族成員之一，其水平及活性變化代表著嗜中性多形核白細胞的功能和活性狀態，主要存在于中性粒細胞嗜天青顆粒中，因此MPO活性可作為中性粒細胞的標記物，定量反應白細胞浸潤的數量，也是作為炎癥調節的基本成分，其活性的變化可對早期組織損傷做出較敏感的反應。PPAR-α主要在人體重要臟器特別是肝細胞中表達，通過調控相關基因，調節肝臟脂質代謝，減輕氧化應激反應，抑制炎癥因子產生和釋放，減輕或阻止肝組織損傷[15-19]。本課題組前期研究表明，TAE后癌旁肝組織的炎癥因子如TNF-α、IL-10水平升高，同時，抗氧化酶活力明顯下降，MPO水平下降，引起氧自由基釋放增多，在肝組織中炎性細胞聚集、浸潤，凋亡細胞增多，導致肝組織損傷，肝功能下降[20-22]。

本研究結果顯示，肝癌TAE術后肝功能下降，經過PPAR-α激動劑WY14643預處理之后，肝功能損傷減輕，與對照組比較，TAE組癌旁肝組織中SOD、GSH-PX、CAT和MPO水平降低，而給予WY14643 處理治療后癌旁肝組織中上述指標水平明顯升高，說明WY14643可通過降低癌旁肝組織的氧化應激作用而減輕肝組織損傷。

綜上所述，WY14643可減輕肝癌TAE術后，肝細胞缺血缺氧，癌旁組織發生氧化應激導致的肝細胞損傷，機制可能是WY14643促進SOD、CAT、GSH-PX、MPO等抗氧化酶活性的表達，抑制癌旁肝組織氧化應激的發生。本實驗從動物水平研究PPAR-α激動劑WY14643在肝組織損傷中的治療作用，有利于尋找新的、安全有效的保護肝功能、減輕肝損傷的方法，對于改善肝臟 TAE 術后患者的生存率，具有非常重要的理論與臨床實踐的指導意義。