ICP-OES法測定余甘子不同器官中11種微量元素①

袁建民 何 璐 楊曉瓊 許智萍 趙瓊玲瞿文林 雷 虓 孔維喜

(1云南省農業科學院熱區生態農業研究所 云南元謀651300;2云南元謀干熱河谷植物園 云南元謀651300)

余甘子（Phyllanthus emblicaL.），俗稱滇橄欖，又稱油甘子、回甘子、喉甘子等，因其吃起來“先苦后甜”而得名。余甘子屬于大戟科葉下珠屬落葉喬木或灌木，是一種十分獨特的分布于熱帶、亞熱帶干熱河谷地區的資源植物。余甘子原產于中國、印度、泰國、馬來西亞、巴基斯坦等地，目前已引種到南非、美國、澳大利亞等地，中國和印度分布面積最大，產量最高［1]。在中國，余甘子資源相當豐富，主要分布于云南、海南、廣東、廣西、福建、臺灣等地，其中大面積栽培以福建、廣西較多，野生資源以云南最為豐富［2]。余甘子染色體組較多，2n＝104，為四倍體，是葉下珠屬中少有的具核果的植物。余甘子分布于海拔80～2 300m，東經70～122°，北緯1～29°的廣大地域，余甘子喜光，耐干旱，耐貧瘠，忌寒霜，對不同海拔不同生態環境具有很強的適應能力。在中國云南金沙江干熱河谷區域內，分布著大面積余甘子自然野生資源，估計資源總面積為2×104hm2。余甘子營養豐富，風味獨特，含有多種對人體有益的微量元素，如Fe、Mn、B、Zn、Se等元素，此外富含維生素、酚類、黃酮、氨基酸、多糖等活性物質［3]，具有抗炎抑菌［4-5]、抗腫瘤［6-8]、抗氧化［3]、降血糖［9-10]、降血壓［11]、降脂［11]等藥理保健作用。研究表明，余甘子整株都是寶，果實、枝葉和根莖均有很好的開發利用價值［12-13]。余甘子故被國家衛生部列入首批藥食兼用名單，并被聯合國衛生組織指定為全世界推廣種植的3種保健植物之一，現已載入《中國藥典》。

微量元素在植物的生理活動中發揮著重要作用，微量元素與人體健康同樣關系密切，具有酶激活作用、宏量元素運載作用、核酸代謝作用和參與激素作用等生物功能［14]，對人體的養生保健、防病治病和延年益壽具有重要作用。因此，對余甘子不同器官中微量元素組成及含量的分析檢測十分有必要。

微波消解法是近年來主流的一種樣品前處理方法，是密閉式消解方法的一大進步，目前被研究人員廣泛應用［15-18]。已有研究報道，元素分析測定通常采用分光光度法、原子吸收光譜法和原子熒光光譜法等，但存在檢出限差、分析效率低、抗干擾能力弱等問題，而電感耦合等離子體發射光譜法（ICP-OES）具有線性范圍寬（5～6個數量級）、精密度高（RSD＜1.0%）、檢出限低（可至ppb級）、分析效率高、無化學干擾、多元素同時檢測等優點，已成為近年來元素分析的主要手段。利用 ICP-OES 法測定枇杷［19]、含笑［20]、馬纓丹［21]和蔬菜［22]等植物中的元素含量已有報道，然而利用ICP-OES法測定余甘子不同器官中多種元素的組成與含量卻鮮見報道。鑒于此，本研究采用ICPOES法測定余甘子不同器官中Zn、Cd、Pb、Co、Ni、B、Mn、Fe、Cr、Mg、Cu等11種微量元素，結合微波消解法進行樣品前處理，以期對余甘子微量元素組成與含量有更深入的了解，為余甘子的有效開發和綜合加工利用提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

供試材料為3份（編號A、B、C）不同來源地余甘子材料的不同器官，分別為根、莖、葉、果實、種子（表1），采集時間為2018年10月10日，采集時期為結果期，均由云南省農業科學院熱區生態農業研究所分析測試中心野外采集。

表1 供試野生余甘子材料

1.1.2 儀器和試劑

微波消解儀，意大利Mi lestone Ethos up（maxi-44）；電感耦合等離子體發射光譜儀（ICPOES），德國耶拿PQ-9000；超純水儀，優普UPHIV-20T；Al、As、B、Ba、Be、Bi、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Ga、Li、Mg、Mn、Ni、Pb、Sb、Sn、Sr、Ti、TI、V、Zn多元素標準溶液（24種，100μg/mL），GSB04-1767-2004，國家有色金屬及電子材料分析測試中心；濃硝酸（優級純），重慶川東化工；過氧化氫（優級純），天津市化學試劑；試驗用水均為超純水；容量瓶、燒杯等玻璃器皿均用10%硝酸浸泡24 h，均用超純水清洗，烘干，備用。

1.2 方法

1.2.1 儀器工作條件

試驗中微波消解儀的運行程序如表2所示，電感耦合等離子體發射光譜儀的儀器參數設置如表3所示。

表2 微波消解程序

表3 ICP-OES儀器主要參數

1.2.2 樣品前處理

將供試樣品用流水清洗干凈，分成小塊，裝入紙袋于60℃烘箱中烘干，然后粉碎，備用。用萬分之一天平精密稱定樣品0.200 0 g（干重），置于聚四氟乙烯高壓微波消解罐中，加入5mL濃硝酸和3mL過氧化氫，擰緊消解罐，確保完全密封。按照設定好的消解程序加熱消解（表2），消解完畢后，冷卻至室溫，慢慢打開密閉消解罐，以少量2%HNO3洗滌消解罐與蓋子2～3次，洗液合并轉入50mL的容量瓶中，用2%HNO3定容至刻度，混勻。用50mL注射器吸取樣品，然后通過0.45μm的一次性過濾器進行過濾，將濾液轉入50mL的離心管中，待上機測試，同時制備空白樣品。

1.2.3 標準曲線配制

采用梯度稀釋法，用微量移液槍精確吸取100μg/mL的多元素混合標準溶液10mL，定容于100mL容量瓶，制成10μg/mL的標準溶液母液，再從母液中分別吸取標準溶液各0.00、0.50、2.50、5.00、12.50、25.00mL，用2%HNO3進行稀釋，定容于50mL容量瓶中，配制成0.00、0.10、0.50、1.00、2.50、5.00mg/L的多元素混合標準溶液，待上機測試。

1.2.4 標準物質的檢測

為進一步判斷該方法的準確度和可靠性，將上述配制的中等濃度（1.00mg/L）標準溶液當作樣品進行重復測定3次，計算該標準物質的相對誤差（%）。

相對誤差＝［（測定值－標準值）/標準值]×100%。

1.2.5 待測樣品的檢測

將供試3份余甘子材料不同器官（根、莖、葉、果實、種子）的待測溶液依次進樣，分別進行Zn、Cd、Pb、Co、Ni、B、Mn、Fe、Cr、Mg、Cu共11種微量元素質量濃度的測定分析，重復測定3次。

1.2.6 加標回收試驗

將余甘子果實樣品A待測溶液用移液槍各吸取5.0mL，共6份，精確加入10μg/mL的多元素混合標準溶液各50μL，利用渦旋混合器重復混勻2～3次，然后進行上機測試，重復測定6次，計算樣品加標回收率（%）。樣品加標回收率公式為：

樣品加標回收率＝［（加標后溶質質量－加標前溶質質量）/加標值]×100%。

1.2.7 數據分析

所有數據均采用Microsof t Excel 2003軟件進行處理，采用SAS 9.0軟件進行多重比較和方差顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 消解體系的選擇

供試樣品含有豐富的有機物質，故以濃HNO3添加H2O2的消解體系進行樣品的消解。本研究采用微波消解法，對升溫時間和溫度保持時間進行優化，最終按照表2微波消解程序進行消解，壓力上升速度快，樣品中有機物能夠消解徹底，溶液澄清透明無渾濁，消解效果很好。可能是由于H2O2分解產生的高能態活性氧有利于有機物質的破壞，使得樣品能夠消解得更為完全。

2.2 檢測波長的選擇

ICP-OES檢測過程中，待測各元素可供選擇的檢測波長有好幾條，本試驗根據ICP-OES檢測波長互不干擾、譜線強度、背景等效濃度（BEC值）、靈敏度高等原則進行分析譜線的選擇，最終確定待測11種元素的檢測波長分別為Zn206.200、Cd214.441、Pb220.353、Co228.615、Ni231.604 、B249.773、Mn257.610、Fe259.940、Cr267.716 、Mg279.553和Cu324.754 nm（表4）。

表4 檢測波長的選擇

2.3 標準曲線和檢出限

按照表3中ICP-OES儀器工作條件，測試多元素混合標準溶液，繪制標準曲線并計算出回歸方程及相關系數，同時按測試方法進行11次試劑空白，計算出檢出限和定量下限，結果見表5。

表5 11種微量元素的線性及檢出限

由表5可知，在線性范圍內，Zn、Cd、Pb、Co、Ni、B、Mn、Fe、Cr、Mg、Cu共11種元素的線性關系較好，相關系數（r）為0.998 0～0.999 9，檢出限為0.000 055～0.081 500 mg/L，定量下限為0.000 2～0.244 6mg/L。

2.4 標準物質的分析

為了驗證本方法的準確性和可靠性，本研究把配制的中等濃度（1.00mg/L）的多元素混合標準溶液當作樣品進行重復測定3次，計算其相對誤差，測試結果見表6。

由表6可知，測定值和標準值基本一致，除了Mg（8.0%）之外，相對誤差均較低，在1.0%～4.0%；各元素相對標準偏差（RSD）均低于2.0%，在0.25%～1.58%。結果表明，該方法準確可靠，測試精密度高。

2.5 樣品元素含量的測定

按照本方法對供試3份余甘子材料不同器官的11種微量元素含量進行測定分析，測試結果見表7。

表6 標準物質中11種微量元素的測定結果（n＝3）

由表7可知，各元素含量分布存在一定規律，不同材料不同器官中，含量較高的元素均為Zn、Mn、Fe、Mg；含量較低元素為 Cd、Pb、Co、Ni、B、Cr、Cu。進一步對各器官中均檢出的Zn、Ni、B、Mn、Fe、Mg、Cu元素進行方差分析（表8）。

由表8可知，Zn、B、Mn、Fe、Mg、Cu各元素在不同器官中的含量存在顯著性差異，Ni元素含量各器官間差異不顯著。Zn元素含量高低順序為根＞莖＞葉≈果實≈種子；Ni元素含量為根≈種子≈果實≈葉≈莖；B元素含量為葉＞根≈莖≈果實≈種子；Mn元素含量為根≥葉≥莖≥果實≥種子；Fe元素含量為根＞葉＞果實＞種子≈莖；Mg元素含量為根≥莖≈葉≥果實≈種子；Cu元素含量為果實＞葉≈種子＞根≈莖。說明余甘子不同器官對不同元素的吸收具有一定的選擇性，不同器官的各元素之間可能存在相互作用（促進作用或拮抗作用），各元素具體作用及相關機理機制有待進一步深入研究。

2.6 加標回收試驗

取樣品果實A號各6份，分別吸取5mL，然后精確加入一定量的24種元素混合標準溶液，按本試驗儀器工作條件進行測定，以標準曲線計算含量，測試結果見表9。

表7 樣品中11種微量元素的測定結果

由表9可知，供試樣品中Zn、Cd、Pb、Co、Ni、B、Mn、Fe、Cr、Mg、Cu平均回收率為90.00%～111.65%；相對 標 準 偏 差 （RSD） 為 0.18%～1.37%。結果表明，該方法準確度高、精密度高、可靠性強，適合批量樣品多元素同時測定。

表8 余甘子不同器官樣品中各元素含量平均值

表9 加標回收試驗的測定結果（n=6）

3 討論與結論

微量元素不僅是人類營養所必需，也是植物生命活動所不可缺少的［23-25]。關于余甘子果實中微量元素的研究已有報道［26]，而對余甘子不同材料不同器官（根、莖、葉、果實、種子）微量元素的差異性研究卻鮮見報道。本試驗對來源于云南干熱河谷特色植物資源3份余甘子材料不同器官中Zn、Cd、Pb、Co、Ni、B、Mn、Fe、Cr、Mg、Cu等11種微量元素進行分析測定，結果表明，余甘子不同材料不同器官中均富含Zn、Mn、Fe、Mg元素，這與蔡英卿等［27]和駱建祥等［28]的研究結果相類似，且含量均高于10mg/kg，含量高低規律為Mg＞Fe＞Zn＞Mn。有研究表明，余甘子中Zn、Mn、Fe、Mg等元素含量與蛋白質、維生素、有機酸、粗纖維、粗灰分和水分等營養成分存在密切相關性［25]。近年來，余甘子根部的植物化學研究是關注的熱點，有學者已從余甘子根中分離得到新的三萜類化合物，并進行了抗癌細胞毒性鑒定［29]。余甘子不同器官中Zn、Mn、Fe、Mg等元素含量豐富，這可能與余甘子具有清熱解毒、生津止咳、利咽祛痰、抗炎抑菌、抗癌抗腫瘤等藥用價值有關。本試驗中Cd、Pb等有害重金屬均未檢出，說明余甘子的野生生長環境未受到污染，可見余甘子不同器官均可以安全地進行有效開發利用。余甘子同一材料不同器官中各元素含量分布差異顯著，可能是由于余甘子不同器官的生理功能及生長發育階段不同，造成余甘子不同器官對元素的吸收和富集的差異，這對指導余甘子不同生育期科學施肥以提高品質產量具有重要意義。此外，同一器官同一元素在不同余甘子材料間也存在較大差異，這可能與材料本身的遺傳特性有關，說明云南余甘子種質遺傳多樣性高，野生資源豐富，可從野生資源中直接選育優良單株或新品種，應該對野生余甘子資源加以保護利用。關于不同來源地余甘子材料中各元素的代謝途徑規律、相互作用以及材料間各元素分配差異產生的原因，還有待深入研究。

消解方式及條件的選擇，是影響分析測試結果準確性的關鍵因素［30]。本試驗根據文獻資料及前期預試驗，最終確定5mLHNO3＋3mLH2O2的消解體系，二者比例為5∶3，總體積控制在10mL以內，以保證消解罐中溶液不會過多，避免壓力過大而發生爆炸。結果表明，該方法消解能力強，簡便高效，一次性可以消解樣品多達44個，消解時間僅需1.5 h左右，余甘子根、莖、葉、果實和種子等不同器官均能消解徹底，溶液澄清透明無渾濁，獲得了很好的回收率，供試樣品中11種元素的加標回收率為90.00%～111.65%，可為其他干熱河谷植物樣品的前處理提供借鑒。

現有對余甘子微量元素的檢測多采用傳統分析方法，也未對檢測方法的準確性和可靠性作深入研究［27-28]。本研究采用微波消解對余甘子不同器官樣品進行前處理，利用ICP-OES測定Zn、Cd、Pb、Co、Ni、B、Mn、Fe、Cr、Mg、Cu等11種微量元素的含量，該方法克服了現有技術中線性范圍窄、精密度低、檢出限差、樣品用量大、分析速度慢、存在化學干擾、不能多元素同時檢測等技術缺陷，具備簡便高效快捷、結果準確可靠、精度高、重現性好等優勢，可用于余甘子及其他干熱河谷植物批量樣品的多元素同時測定。試驗結果表明，余甘子富含多種人體必需的微量元素，而重金屬元素含量很低，安全健康無污染，營養價值和藥用價值高，是十分重要的藥食兼用資源植物。本研究可以為今后余甘子的有效開發和綜合利用提供數據參考。