‘增城蜜菊’莖尖培養脫毒技術①

何旭君 趙 靜 賴增哲 羅晶晶 張華通③

(1廣東生態工程職業學院 廣東廣州510520;2廣州田園牧歌農林有限公司 廣東增城511300)

菊 花 （Chrysanthemum×morifol iumRamat.）為菊科菊屬植物的干燥頭狀花序。具有疏風散熱、清肝明目、解瘡毒的功效。現代藥理試驗證明，菊花具有改善心血管功能、抗癌、抗菌、擴血管、抗氧化等作用［1]。2015版《中國藥典—I部》中，菊花被收錄為藥食同源植物，具有較高的經濟價值［2]。由于它可以在林間地頭、山坡地種植，近年來也成為一種重要的林下經濟植物，被廣泛應用。《本草綱目》中有“菊之品九百種”的記載，其中杭菊、亳菊、滁菊、懷菊最為有名，有“四大名菊”之稱。‘增城蜜菊’是廣州田園牧歌農林有限公司引種徽州亳菊，并從中選育出的良種。亳菊是菊花中的珍品，2014年被中國農業農村部登記為地理標志性農產品，亳菊疏風散熱、解暑明目，多為春、夏兩季用藥，歷年來為中醫首選的菊花品種［3]。

菊花通常以嫁接、扦插、分株的方式進行無性繁殖，長期的這種營養繁殖會使病毒積累，日趨嚴重，造成生長不良，品質和產量也隨之下降，影響經濟效益。據國內外報道，侵染菊花的病毒多達20多種，其中菊花B病毒（Chrysanthemum virus B，CVB）和番茄不孕病毒（Tomatoaspermy virus，TAV）為侵染、危害菊花的優勢病毒［4-5]，受感染的植株表現為矮小，花朵畸形、褪色、變小，甚至皺縮、扭曲、枯斑、壞死等，嚴重地減少了菊花的產量、降低了菊花的品質。‘增城蜜菊’在栽培種植的過程中，也表現出這兩種病毒侵染的癥狀，花朵變小或花形殘缺等，極大地影響了產量和品質。為了良種的推廣和應用，勢必要對種苗進行脫毒，獲取脫毒苗。

目前，植物脫毒的方法主要有莖尖培養脫毒法、熱處理脫毒法、化學脫毒法等［6]。這些脫毒方法各有利弊，在菊花無毒苗生產中都有應用［7-9]。為獲得‘增城蜜菊’的脫毒苗，本研究利用‘增城蜜菊’組培苗為材料，進行微莖尖組培脫毒，總結出一套菊花組織培養微莖尖脫毒技術，以利于‘增城蜜菊’的進一步推廣應用。

1 材料與方法

1.1 材料

以‘增城蜜菊’的組培苗作為莖尖脫毒材料。

1.2 方法

1.2.1 組培苗的獲得

以廣州田園牧歌農林有限公司選取出的‘增城蜜菊’優株而表現輕微帶毒病征的植株，采其頂芽為外植體，用0.1%的HgCl2溶液表面消毒7 min，無菌水沖洗5次。將消毒好的材料切成約1.5 cm長的小段（帶有1～2個腋芽）接種到MS＋6-BA 1.0 mg/L＋蔗糖30 g/L的誘導培養基進行不定芽誘導，將誘導形成的芽轉入MS＋NAA 0.1mg/L＋蔗糖30 g/L培養無菌組培苗。

1.2.2 莖尖切取

在超凈工作臺內，選取健壯組培苗，將苗取出放在已消毒品的培養皿中，在體視顯微鏡下進行莖尖剝離，直到出現圓滑生長點時，用滅過菌的解剖刀分別切取0.5、1.0、1.5、2.0mm莖尖，每處理分別切取50個莖尖，接種于微莖尖不定芽誘導培養基中培養，誘導成功的不定芽繼續轉到MS＋6-BA 2.0mg/L＋蔗糖30 g/L進行繼代增殖培養，統計莖尖成活率。重復3次試驗。

1.2.3 微莖尖誘導

以MS為基本培養基，采用兩種莖尖誘導培養基，JH7：MS＋6-BA 0.1mg/L＋椰子汁100mL/L＋蔗糖30 g/L，JH6：MS＋6-BA0.1mg/L＋蔗糖30 g/L。將不同長度莖尖分別接種于誘導培養基JH7和JH6兩種培養基后，放入培養室進行培養，誘導不定芽，統計莖尖誘導率。誘導成功的不定芽繼續轉到MS＋6-BA 2.0mg/L＋蔗糖30 g/L進行繼代增殖培養，誘導芽叢。將芽叢單芽切下接種到生根培養基MS＋NAA 0.1mg/L＋蔗糖30 g/L，獲得完整的植株。培養室溫度為（25±2）℃，光照2 500～3 000 lx。

1.2.4 脫毒苗檢測

根據NCBI GenBank（The Nat ional Center for Biotechnology Information）中收錄的菊花B病毒（CVB）和番茄不孕病毒（TAV）的基因序列，應用Primer premier5.0軟件，分別設計相應引物，NCBI Primer BLAST在線設計引物。根據已有的菊花CVB、TAV病毒的基因序列各設計一對引物，CVB-F：ggcagaagaagcgaacccta；CVB-R：ccct t tggggtct tggtagc，擴增產物385 bp和TAV-F：catcctccccgt tggaaaga； TAV-R： aacaagctcgggtcacctac，擴增產物408 bp，引物由北京睿博興科生物技術有限公司合成。使用Invit rogen公司Trizol試劑盒，按其使用指導書提取總RNA。使用 TransScript?Al l-in-One First-St rand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑盒合成cDNA，Taq酶，10×EXTaq Buf fer，2.5 each dNTP均購自Takara。PCR反應在20μL體系中進行：10×EX Taq Buf fer 2μL，2.5 each dNTP 1.6μL，前后引物各0.6μL，無菌水14.58μL，EX Taq酶0.12 μL，cDNA 0.5μL，加完樣后混勻后于PE 9600擴增儀上完成如下的PCR循環反應：94℃2 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s； 72℃ 45 s， 94℃ 30 s ，60℃30 s；72℃45 s循環30次；最后72℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖電泳后，于凝膠成像系統下觀察。

2 結果與分析

2.1 脫毒單株的誘導

在體視顯微鏡下切下幼小的微莖尖（頂端生長錐）接種入培養基，微莖尖能夠較快的適應培養環境，在誘導培養基上生長約1周左右就開始生長膨大（圖1-A）。隨著，莖尖繼續生長，葉長出形成芽苗，40 d左右可長高達2～3 cm（圖1-B），觀察其誘導率。把形成的芽苗轉入叢芽誘導培養基，經25 d左右培養，即可誘導形成叢芽（圖1-C），此時，采樣進行脫毒效果檢測。如果將芽叢單芽切下接種到生根培養基，放入培養室培養，7 d左右開始生根，20～25 d左右就可以得到完整的植株（圖1-D）。

2.2 培養基類型和莖尖大小對微莖尖誘導的影響

將獲取的不同長度莖尖分別接種于誘導培養基JH7和JH6培養基上，放入培養室培養40 d后記錄存活的莖尖數和生長表現情況。如表1所示，采用JH7培養基的微莖尖平均存活數在26.33～43.67，平均誘導率都在50%以上，最高達到了87.33%，誘導效果較好，誘導成功的微莖尖大部分出現綠色小點，開始萌發。而采用JH6培養基的微莖尖，存活數在13.00～36.33，平均誘導率從26.00%到72.67%。方差分析表明，JH7培養基的誘導效果顯著高于JH6，表明在培養基中加入椰子汁，可以顯著的提高‘增城蜜菊’微莖尖的存活數和誘導率。

圖1‘增城蜜菊’微莖尖生長成苗過程

微莖尖的大小顯著影響了其存活數和誘導率。如表1所示，在JH7、JH6培養基上都有著相同的趨勢，隨著所取莖尖的長度的增加，平均存活數和平均誘導率都在顯著增加。在JH7和JH6培養基中，取2.0mm莖尖時的平均誘導率是取0.5mm莖尖時的1.66倍和2.79倍，表明所取的莖尖越大越有利于莖尖的存活和誘導。

表1 培養基類型和莖尖大小對微莖尖誘導的影響

2.3 脫毒苗的病毒檢測

隨機選取2株‘增城蜜菊’的母株進行TAV和CVB病毒檢測，結果這兩株植株里都帶有TAV和CVB病毒圖2。

對不同大小的微莖尖誘導成的苗，進行RTPCR病毒檢測，發現當莖尖大小為1.0、1.5、2.0 mm時，所獲得植物，脫毒情況不穩定，有時能檢測出其中一種病毒，有時甚至兩種病毒都能夠檢測到，脫毒不徹底，但當切取的莖尖為0.5mm時，所獲得植株的TAV和CVB病毒檢測都為陰性（圖3），表明要想獲得穩定的‘增城蜜菊’脫毒苗，切取0.5 mm的莖尖誘導成苗的脫毒效果好，且穩定。

圖2 ‘增城蜜菊’母株的病毒檢測

3 討論與結論

目前，國內外報道能侵染菊花的病毒多達20多種，病毒特點不同，脫除的難易程度也不同［4-5]。在這些侵染菊花的病毒中CVB和TAV病毒對菊花侵染高、危害嚴重。如VERMA等［11]利用DAS-ELISA對生長在印度喜馬偕爾省的菊花進行CVB病毒檢測，發現其侵染率最高可以達到94.6%。而MEIJU等［12]對臺灣9個地區采集的504菊花樣品進行CVB病毒檢測，發現CVB病毒感染率高達78%左右。而在福建省的菊花中，TAV病毒侵染率達到了85.9%，造成花朵畸形、褪色、變小，甚至皺縮、扭曲、壞死等，對菊花的生產、銷售帶來很大威脅［13]。‘增城蜜菊’是通過選育出來的新品種，在林間地、山坡地種植具有較強的優勢，能充分利用林地，保護生態環境，同時給林農增加收入。‘增城蜜菊’在栽培過程中表現出了CVB和TAV病毒侵染的表型，影響了產品的產量和質量，通過RT-PCR鑒定，在母株中發現這2種病毒的存在（圖2）。利用植物組培技術，獲取脫毒苗是保障種苗質量，有利于品種的進一步推廣應用。

獲得脫毒種苗的方法有莖尖脫毒法、化學處理法、熱處理法等。莖尖脫毒利用的是病毒在植物體內分布的不均勻性，在植物生長點或生長點附近無病毒或病毒濃度很低的特點，切取不帶毒的生長點培養成苗［14-15]。一般認為，在生產應用中進行脫除病毒時，剝取的莖尖越小，其脫毒效果越好。報道表明，在莖尖為0.1～0.2mm時，脫毒率可達到100%［16]。趙蘭勇等［16]做到采用0.3～0.5 mm的莖尖時，脫毒率可達到78.5%～88.5%，這高于本實驗的脫毒率（約60%）。但是隨著莖尖增大，在莖尖為1.0mm時，該研究表明已經完全脫毒失敗［16]。但在本實驗中，即使2.0mm的莖尖，也可達到約40%的脫毒率。眾所周知，隨著剝離莖尖的縮小，成活率就會相應降低，剝取的操作難度也大會幅度增加，與本研究相符合（表1）。因此，本試驗結果通過增大莖尖而提高了莖尖脫毒操作及成活率，為菊花的莖尖脫毒提供了重要的參考。

化學藥劑用于病毒的脫除，主要是利用了化學物質對植物病毒有體外鈍化作用，或者在活體內有抑制病毒及治療作用，或者可以誘導寄主植物產生與病毒相關的蛋白，從而提高植株的抗病性［17]。化學藥劑在實際應用中不同植物會有不同程度的藥害，需要做前期的摸索，弄清化學藥劑的使濃度和處理時間，如比較廣泛應用的病毒唑在使用時就要小心［18]。藥劑處理操作簡單，脫毒效率較高，但是處理時間比較長，不同的病毒種類對不同種類的藥劑反應不同。熱處理法脫毒是利用病毒和寄主植物對高溫忍耐性的不一樣，將帶病毒的植物組織處于高于正常溫度的適當高溫環境，寄主植物組織很少或不會受到傷害，而這種溫度可部分或完全鈍化植物組織中的病毒，從而達到去除病毒的目的［19-20]。

熱處理只對那些球狀的病毒或線狀的病毒有效果，而對桿狀病毒不起作用［21]，對于一些耐熱的病毒，這種方法也不適合。這些脫毒方法在菊花脫毒苗的獲得中都有研究者用，由于每個方法各有優缺點，也有研究者將其中兩種方法結合起來應用［22-24]。趙霜等［22]比較了不同方法脫除“墨菊”體內CVB、黃瓜花葉病毒（C M V）及煙草花葉病毒（T M V）的效果，結果表明直接剝莖尖操作簡單，但脫毒效果不強；病毒唑結合莖尖培養法，其脫毒效果雖較前者強，但對植物存在一定的藥害作用；熱處理結合莖尖培養法的脫毒效果最強，但是熱處理持續的時間較長且需要一定的儀器設備，繁殖一批脫毒苗的周期相對較長。在幾個處理中熱處理結合莖尖培養法的效果最好，但這種方法對不同病毒的脫毒效果有差異，生產上要根據病毒自身的性質選擇適宜的脫毒方法。

本研究中以組培苗為材料，直接切取無菌的莖尖作為外植體進行脫毒，結果表明污染少，成苗率高。在JH7的培養基中，即使莖尖切取到0.5 mm時，誘導率仍能達到52.67%，脫毒率為100%（表1，圖3），能大大滿足生產的需要。趙蘭勇等［16]切取0.3～0.5 mm的莖尖時，脫毒率達到78.5%～88.5%，低于本實驗。同時，這樣也避免了使用2種方法結合起來，才能達脫毒的繁瑣。因此，在實踐中，需要進一步研究不同品種最佳脫毒效果的相關條件和在生產中采用受市場青睞又容易脫毒的優良品種。

莖尖的誘導成功是莖尖脫毒成功的關鍵步驟。本研究還分析了椰子汁對‘增城蜜菊’莖尖的誘導的促進作用。由于椰子汁等天然有機物汁液含有氨基酸、植物激素、酶、微量元素等物質而營養豐富，在培養基內加入這些天然有機物能夠增強培養物的增殖與分化效應，促進培養物更快更好地生長發育［25]。胡燕梅等［26]研究發現，椰子汁等5種天然有機物的添加有利于大花蕙蘭類原球莖的增殖與分化。而在貢菊的培養基中加入椰子汁可以顯著的促進貢菊組培苗的壯苗生長［27]。甜葉菊組培時，在培養基中添加椰子汁能促進試管苗的增殖［28]。本研究中，在莖尖誘導培養基中添加椰子汁，對不同長短莖尖的誘導都有促進作用（表1），進一步證明了椰子汁對組織培養的增殖和分化作用。但是由于生產天然有機物的成分及本身的濃度具有不穩定性，受到來源植物產地、品種、季節、株齡、氣候、栽培條件等多種因素的影響，以致其有利于培養物生長和分化的成分不穩定，在具體使用時需要做前期的探索研究。

本研究采用的脫毒路徑是先用帶毒材料建立起無菌繁殖體系后，再用建立起的無菌繁殖體系的頂芽切取微莖尖體進行脫毒，雖增加了脫毒的操作工序，但這條路徑比傳統的外植體消毒后直接剝離微莖尖的路徑，顯示脫毒切取的莖尖可以更長，技術難度更低，而成功率比較高。我們的實驗研究表明，切取2.0mm的莖尖，也可達到大約40%脫毒率（表1），而趙蘭勇等［16]在切取莖尖為1.0mm及以上時的脫毒已失敗了。因此，本實驗采用的微莖尖脫毒技術操作方法具有一定的生產實踐意義。