氟對體外培養LS8細胞增殖、氧化應激與凋亡的作用研究

李玨丹 崔敏

[摘要]目的：觀察氟化物對小鼠成釉細胞樣細胞（LS8細胞）增殖、氧化應激以及凋亡的影響。方法：取對數生長期的LS8細胞，在培養液中分別加入終濃度為0、0.5、1、2、4和8mM的氟化鈉（NaF）溶液，培養24h和48h后，CCK-8檢測細胞增殖;倒置顯微鏡觀察細胞形態;生化方法檢測細胞丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性;qRT-PCR檢測過氧化氫酶（Cat）、谷胱甘肽過氧化物酶1（Gpx-1）和谷胱甘肽S轉移酶（Gst）mRNA水平;流式細胞術檢測細胞凋亡;Western blotting檢測caspase-9和caspase-3蛋白表達改變。結果：過量氟抑制LS8細胞增殖，且隨著NaF濃度增加，細胞增殖呈下降趨勢;過量氟顯著增加LS8細胞內MDA含量，降低SOD活性及Gpx-1、Gst mRNA表達水平;過量氟引起LS8細胞形態改變和細胞凋亡，且伴隨著caspase-9，caspase-3表達的顯著增加。結論：過量氟抑制LS8細胞增殖，擾亂細胞的氧化與抗氧化平衡并誘發氧化應激，持續的氧化應激最終導致細胞凋亡。

[關鍵詞]氟化物;LS8細胞;增殖;氧化應激;凋亡

[中圖分類號]R329.2+8? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2019）09-0089-04

牙釉質發育期，機體長期攝入過量氟可導致氟牙癥發生，引起牙釉質白堊色條紋或斑塊，重者伴釉質缺損，嚴重影響患者的咀嚼功能和顏面美觀[1-2]。然而氟牙癥缺乏有效治療手段，因而探究氟牙癥發病機制，對于有效控制氟牙癥發生具有重要現實意義。釉原蛋白在釉質形成后期未得到充分降解而滯留于釉基質中，影響釉質礦化，導致氟牙癥發生[3-4]。釉原蛋白滯留的機制主要包括過量氟對釉基質蛋白、釉基質蛋白酶及成釉細胞的影響等，多數學者認為過量氟可下調成熟成釉細胞中釉基質蛋白酶KLK4表達[3，5-6]，對釉基質蛋白酶MMP20及釉基質蛋白的表達無明顯影響[3，5，7-8]。目前過量氟對成釉細胞增殖、氧化應激和凋亡的影響報道較少且尚未完全闡明。本研究用不同濃度氟化鈉（sodium fluoride，NaF）作用于體外培養的小鼠成釉細胞樣細胞（LS8細胞），觀察其對細胞增殖、氧化應激和凋亡的影響，為研究氟牙癥的發病機制提供科學依據。

1? 材料和方法

1.1 實驗試劑：LS8細胞由美國南加州大學分子生物學實驗室Malcolm L. Snead教授饋贈，高糖DMEM培養基、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶（Hyclone，美國），胎牛血清（FBS，Gibco，美國），Annexin V-PE/7-AAD（BD Biosciences，美國），RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、Marker（Thermo Fisher Scientific，美國），SYBR?Premix Ex TagTM試劑盒（TaKaRa，日本），RIPA裂解液（Beyotime，中國），caspase-9、caspase-3抗體（Cell Signaling Technology，美國）。

1.2 實驗儀器：Thermo Forma二氧化碳培養箱（Thermo Fisher Scientific，美國），自動酶聯檢測儀（Tecan，奧地利），實時定量PCR儀（Agilent Technologies，美國），微量核酸蛋白定量儀Nano Drop 2000（Thermo Fisher Scientific，美國），凝膠成像分析系統（Gene有限公司，美國）。

1.3 實驗方法

1.3.1 LS8細胞培養與傳代：用10% FBS、100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的高糖DMEM培養液，在37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養LS8細胞，隔天換新鮮培養基。待細胞融合至培養瓶的80%～90%時胰酶消化，傳代培養。

1.3.2 細胞增殖活力檢測：用終濃度為0、0.5、1.0、2.0、4.0和8.0mM的NaF溶液孵育96孔板中的LS8細胞（100μl/孔），每組3個復孔。24h和48h后，每孔加入10μl CCK-8溶液繼續孵育4h。酶聯儀測定各孔的吸光度值，繪制細胞生長曲線。所有實驗重復3次。

1.3.3 細胞凋亡檢測：終濃度為0、1、2mM的NaF溶液孵育LS8細胞48h后消化，800rpm離心5min，預冷PBS洗滌細胞2次。加入1×Binding Buffer重懸并調節細胞密度1×106/ml，取100μl懸液于流式管內，加入PE Annexin V和7-AAD各5μl混勻后避光、室溫15min后，加入400μl 1×Binding Buffer混勻，樣品于1h內通過流式細胞儀檢測。

1.3.4 細胞氧化應激檢測：用終濃度為0、1、2mM的NaF溶液孵育6孔板中的LS8細胞，24h后每孔加入100μl細胞裂解液，1min后每孔再加入300μl PBS把貼壁細胞充分吹打下來，操作過程均在冰浴上進行。制備好的細胞勻漿用于MDA和SOD的測定。

1.3.5 實時定量PCR檢測：終濃度為0、1、2mM的NaF溶液孵育LS8細胞24h后Trizol試劑提取總RNA，通過酶標儀檢測RNA濃度和純度。根據反轉錄試劑盒操作說明對2μg總RNA進行反轉錄合成cDNA。實時定量PCR儀進行實時熒光定量PCR，PCR反應體系：5μl SYBR Green PCR反應液、0.4μl cDNA模板、1μl PCR引物，加雙蒸水至10μl。β-Actin為內參對照，采用2-ΔΔCT法對樣本進行相對定量。引物序列見表1。

1.3.6 Western blotting：用終濃度為0、1、2mM NaF培養液培養LS8細胞48h后加入RIPA裂解液，冰上裂解后離心收集上清。BCA法測蛋白濃度，取細胞總蛋白25μg，5μl Marker，進行10% SDS-PAGE電泳。在200mA恒流條件下，轉膜1.5h至PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉PVDF膜2h。后分別加入抗兔caspase-9、caspase-3、β-Actin抗體，4℃孵育過夜，TBST洗膜后用山羊抗兔IgG（H+L）二抗室溫孵育1.5h。用TBST洗膜后，將PVDF膜置于凝膠成像分析系統實驗盒中，ECL發光液均勻放置于PVDF膜上，調整參數曝光后用圖像分析儀處理。

1.3.7 統計學分析：數據用（x?±s）表示，使用SPSS 19.0統計軟件，兩組數據間的比較采用Student t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2? 結果

2.1 氟化物對LS8細胞增殖活力的影響：染氟24h和48h，隨著NaF濃度增加，LS8細胞增殖活力逐漸下降，LS8細胞的存活率呈下降趨勢（與0mM比較，P<0.05）。見表2，圖1。

2.2 氟化物對LS8細胞形態的影響：對照組LS8細胞生長狀態良好，細胞輪廓清晰，呈典型的上皮細胞形態，多為長梭形或多角形。與對照組相比，1mM NaF組細胞胞體呈現不同程度的皺縮，出現少量細胞凋亡。2mM NaF組細胞胞體明顯收縮、變小，細胞形態發生明顯改變，細胞數量明顯下降，間隙增大，凋亡細胞數目明顯增多。見圖2。

2.3 氟化物對LS8細胞氧化應激的影響：NaF作用LS8細胞24h后，MDA含量顯著增加（與0mM比較，P<0.05），SOD活性和Gpx-1，Gst mRNA表達均明顯降低（與0mM比較，P<0.05），然而Cat mRNA表達水平無明顯改變。見圖3。

2.4 氟化物對LS8細胞凋亡的影響：Annexin V-PE/7-AAD雙染法結果顯示：NaF作用LS8細胞48h后，隨著NaF濃度增加，LS8細胞凋亡率逐漸增高（與0mM比較，P<0.05）（圖4A）。Western blotting檢測結果顯示：1mM NaF作用LS8細胞48h后，cleaved caspase-9，cleaved caspase-3蛋白表達輕微增加，2mM NaF作用LS8細胞48h后，cleaved caspase-9，cleaved caspase-3蛋白表達均顯著增加（與0mM比較，P<0.05）（圖4B～D）。

3? 討論

成釉細胞是釉質形成的關鍵細胞[9]。LS8細胞系是分離自小鼠第一磨牙成釉器上皮并被永生化的細胞系，用于釉質發育和氟牙癥發病機制的研究[10-11]。本研究中筆者通過建立體外染氟LS8細胞模型，來觀察氟化物對細胞增殖，氧化應激和凋亡的影響。

氟化物可影響成釉細胞增殖活性，但對其具體作用尚具有爭議。馬林、王琳等[12-14]分別將0、0.4、0.8、1.6、3.2和6.4mM NaF作用于原代培養大鼠成釉細胞和大鼠類成釉細胞系HAT-7 24、48和72h后，發現0.4和0.8mM NaF促進細胞增殖，1.6、3.2和6.4mM NaF則抑制細胞增殖，認為氟化物對成釉細胞增殖具有雙重作用。然而Yang，Zhao等[15-16]將0、0.5、1、1.5、2mM NaF作用于小鼠成釉細胞樣細胞系LS8 24、48和72h時，發現NaF降低LS8細胞增殖活性。本研究中筆者將0、0.5、1、1.5、2、4、8mM NaF作用于LS8細胞24、48h后發現NaF降低LS8細胞增殖活性，呈劑量和時間依賴關系，與Yang、Zhao等結果一致。推測與馬林、王琳等研究結果略有不同的可能原因為選用的細胞系和體外實驗條件不同，導致不同細胞系對氟化物耐受力也不完全相同。研究還顯示4mM、8mM NaF處理LS8細胞24h和48h后，細胞存活率明顯低于50%，因此選用1mM、2mM NaF濃度用于后續實驗。

過量氟攝入可干擾氧代謝引起脂質過氧化反應，同時消耗抗氧化物和自由基清除酶類，導致氧化與抗氧化失調進而誘發氧化應激，對機體造成損傷。脂質過氧化產物MDA的含量和抗氧化酶SOD、Gpx，Gst和Cat的活性常被用作評估氧化應激的重要指標[17-18]。本研究顯示過量氟使LS8細胞中MDA含量增加，SOD活性及Gpx-1，Gst mRNA水平降低，提示過量氟可促進LS8細胞脂質過氧化，降低抗氧化酶活性，使細胞處于氧化應激狀態。結果還顯示過量氟對Cat無明顯影響，推測可能原因為各抗氧化酶對氟敏感程度不一，也可能與復雜的氧化與抗氧化系統有關。

細胞凋亡通路主要包括caspase-9介導的線粒體途徑、caspase-8介導的死亡受體途徑及caspase-12介導的內質網應激途徑[19]。上述途徑最后均通過激活下游caspase-3，引發細胞形態改變，導致細胞凋亡[19]。本文采用Annexin V-PE/7-AAD雙染法檢測示1mM和2mM NaF作用LS8細胞48h后引起細胞顯著凋亡。利用Western blotting發現1mM NaF作用48h時細胞中caspase-9和caspase-3活化蛋白輕微增加，而2mM NaF作用時細胞中caspase-9和caspase-3活化蛋白顯著增加，提示過量氟誘導的LS8細胞凋亡很可能與線粒體凋亡途徑激活有關。值得注意的是，1mM NaF作用LS8細胞48h后，Annexin V-PE/7-AAD雙染法顯示細胞凋亡顯著增加，但Western blotting示caspase-9和caspase-3蛋白輕微活化，推測可能與Western blotting檢測不如Annexin V-PE/7-AAD雙染法敏感有關。

綜上所述，本實驗探究了過量氟對細胞增殖、氧化應激和凋亡的影響，發現過量氟抑制LS8細胞增殖，擾亂細胞氧化與抗氧化平衡并誘發氧化應激，持續的氧化應激最終導致細胞凋亡，而凋亡很可能與線粒體途徑激活有關，其具體機制待深入探究。

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[收稿日期]2019-02-25

本文引用格式：李玨丹，崔敏，許瑩，等.氟對體外培養LS8細胞增殖、氧化應激與凋亡的作用研究[J].中國美容醫學，2019，28（9）：89-92.