男性染色體多態性對IVF/ICSI-ET助孕結局的影響*

劉珊， 史霖， 王婷**

(1.西北婦女兒童醫院 輔助生殖中心， 陜西 西安 710003; 2.西安交通大學 基礎醫學院病原生物學與免疫學系， 陜西 西安 710061)

染色體多態性(chromosome polymorphism)指不同個體間異染色質區存在恒定的微小變異，主要包括常染色體(1、9、16號染色體)長臂次縊痕長度變異、D/G組染色體隨體及隨體柄變異、9號染色體臂間倒位及Y染色體長臂異染色質區長度變異等[1]。傳統觀點認為此類變異不會引起表型效應,但越來越多的研究發現染色體多態性可能與生殖異常如流產、死胎、胚胎停育、男性不育及精子異常等有關[1-3]。染色體多態性對輔助生殖妊娠結局的影響一直存在爭議，有學者認為染色體多態性會增加早期流產率[4-6]，降低臨床妊娠率及活產率[6-9]，對體外受精-胚胎移植妊娠結局造成不良影響，但也有研究結果顯示染色體多態性對輔助生殖妊娠結局無影響[1,10-18]，這些研究所得到不同的結論可能與納入的樣本量、各型染色體多態性所占比例以及統計學方法的不同有關。本研究收集2014年1月-2018年3月西北婦女兒童醫院生殖中心接受體外受精/單精子顯微注射并胚胎移植(IVF/ICSI-ET)治療的男方染色體多態性不孕癥夫婦的相關數據，分析男性常染色體長臂次縊痕長度、D/G組染色體隨體及隨體柄、9號染色體臂間倒位及Y染色體長臂異染色質區長度等變異對體外受精-胚胎移植妊娠結局的影響，同時分析妊娠異常(早期流產和胚胎停止發育)、臨床妊娠和活產的相關影響因素，以探討不同類型男性染色體多態性對IVF/ICSI-ET助孕結局的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2014年1月-2018年3月首次接受IVF/ICSI-ET治療的不孕夫婦作為研究對象,包括單純男方染色體多態患者。根據不同的染色體多態類性分為男性常染色體長臂次縊痕多態、D/G組染色體隨體多態、9號染色體臂間倒位和Y染色體多態4組；同期行IVF/ICSI-ET助孕、且男女雙方染色體均正常的夫婦作為對照組。納入標準:(1)夫婦雙方均≤38歲，(2)女方生殖系統解剖無異常，(3)女方體質量指數(BMI) 18～25 kg/m2，(4)女方基礎卵泡刺激素(FSH)<15 IU/L、基礎竇卵泡數>5。排除標準: (1)女方合并復發性流產、子宮內膜異位癥、子宮腺肌癥、輸卵管積水、子宮內膜息肉、多囊卵巢綜合征以及其他內分泌系統等疾病，(2)男方嚴重的精索靜脈曲張癥以及嚴重的系統性疾病等，(3)男方AZF(azoospermia factor)檢查存在微缺失，(4)女方為染色體多態性，(5)男方同時合并兩種以上染色體多態性。該研究過程符合1964 Helsinki宣言的精神，研究經醫院倫理委員會批準(編號2018012)。

1.2 方法

1.2.1染色體核型分析 接受IVF/ICSI-ET治療前采集患者外周血，分離淋巴細胞,體外培養72 h，收集淋巴細胞制備染色體及G顯帶分析。根據人類細胞學國際命名體制(ISCN2009)進行染色體核型分析。每例至少分析30個中期染色體核型，如有嵌合體存在，則分析100個中期染色體核型。

1.2.2IVF/ICSI-ET助孕 依據患者年齡、卵巢儲備功能情況選擇促排卵方案，根據卵泡發育情況和血清激素水平調整促性腺激素(Gn)藥量，當一個主導卵泡直徑>18 mm或2個主導卵泡直徑>17 mm時，注射重組人絨毛膜促性腺激素(hCG，艾澤，默克雪蘭諾)，36 h后陰道超聲介導下取卵。根據實驗室操作常規進行IVF/ICSI-ET，每個周期移植1～2枚優質胚胎，術后黃體支持。卵巢過度刺激綜合征(OHSS)高風險者取消新鮮移植，行全胚冷凍，未獲卵者不納入本研究。移植術后30 d行陰道B超檢查，見孕囊即為臨床妊娠。

1.3 觀察指標

分析各組患者基本情況、基礎性激素水平、促排卵情況及妊娠結局。記錄下列指標：IVF受精正常受精率=每周期2PN受精卵數目/每周期獲卵數×100%，ICSI受精正常受精率=每周期2PN受精卵數目/每周期MⅡ卵子數×100%，優胚率=優質胚胎數/卵裂胚胎數×100%，移植取消率=取消移植周期數/總周期數×100%，異常妊娠率=(早期流產數+胚胎停止發育數)/臨床妊娠數×100%，早產率=早產周期數/分娩周期數×100%，臨床妊娠率=臨床妊娠數/移植周期數×100%，活產率=有活產嬰兒出生的分娩周期數/移植周期數×100%。同時采用Logistic回歸分析與異常妊娠發生、成功臨床妊娠和活產相關的影響因素，協變量包括各型男方染色體多態性、女方年齡、男方年齡、女方BMI、內膜厚度、基礎雌激素(E2)、基礎黃體生成素(LH)、基礎卵泡刺激素(FSH)、Gn用量、受精方式(ICSI或IVF)、促排方案(短方案或長方案)、獲卵數、MII卵數、正常受精率、可移植胚胎數、優胚數和移植胚胎數。將孕12周前的妊娠終止(流產、或胚胎停止發育)定義為異常妊娠。分娩后隨訪出生嬰兒數、生產方式、是否足月、性別、出生體重、孕周及先天畸形情況等。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 基本情況

本研究共入組患者1 936對夫婦，對照組1 596對夫婦，患者男性常染色體長臂次縊痕多態組84對(38例1qh+、26例9qh+及20例16qh+)，D/G組染色體隨體多態組81對(2例13ps+、1例13pss、7例13pstk+、3例14ps+、1例14pss、8例14pstk+、3例15ps+、1例15pss、8例15pstk+、2例21ps+、2例21pss、22例21pstk+、4例22ps+及17例22pstk+)，9號染色體臂間倒位組25對[均為inv(9)]，Y 染色體多態組150對(22例Yqh-、128例Yqh+)。4個染色體多態組與正常對照組比較，男女年齡、不孕年限、女方BMI、內膜厚度、基礎激素水平及Gn用量等差異無統計學意義(P>0.05)，4個染色體多態組的平均精液濃度和精液活率雖均較對照組降低，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組受試者基本情況和基礎性激素水平Tab.1 General condition and basic sex hormone levels in all groups of subjects

2.2 促排卵、受精及妊娠結局

與正常對照組比較，常染色體次縊痕區多態組、Y染色體多態組臨床妊娠率降低，但差異無統計學意義(P>0.05)；4個染色體多態組的活產率較對照組低，異常妊娠率(早期流產和停止發育)較對照組增高，但差異無統計學意義(P>0.05)；5組促排卵、受精及妊娠結局的其余指標比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組受試者促排情況及妊娠結局Tab.2 Exclusion promotion conditions and pregnancy outcomes in all groups of subjects

注：N此指標下的總例數,n為發生數

2.3 異常妊娠、臨床妊娠及活產相關因素分析

二分類Logistic回歸分析結果顯示，9號染色體臂間倒位和女方年齡與異常妊娠(早期流產和胚胎停止發育)的發生呈顯著正相關；Y染色體多態、女方年齡與成功臨床妊娠呈負相關，內膜厚度、獲MII卵數、優胚數和移植胚胎數與成功臨床妊娠呈正相關；常染色體次縊痕區多態、Y染色體多態、女方年齡和短方案使用與成功活產呈負相關，內膜厚度、獲MII卵數、優胚數和移植胚胎數與成功活產呈正相關。見表3。

表3 異常妊娠、臨床妊娠及活產相關性因素的Logistic回歸分析Tab.3 Logistic regression analysis on related factors of abnormal pregnancy,clinical pregnancy and live birth

3 討論

隨著輔助生育技術的廣泛應用，治療中檢測到行輔助生殖技術助孕的患者中染色體多態的發生率顯著高于普通人群，尤以男性更加明顯[2,19]。但目前對男性染色體多態對生殖功能的影響尚存在爭議,有的研究發現男性染色體多態性會對IVF/ICSI-ET助孕結局造成不良影響[4-9]，有的研究則顯示男性染色體多態性對輔助生殖妊娠結局無影響[1,10-18]。造成這些矛盾結果的一個重要原因為大多數研究并未根據男性染色體多態發生的不同類型，將不同類型的染色體多態性分開研究，而是將多種不同類型的染色體多態樣本混合在一起研究，由于不同類型染色體多態對生殖功能的影響可能不同，且各研究中不同類型染色體多態樣本比例存在差異，因此造成研究結果產生較大偏差。

不同的統計分析方法也會造成研究結果的差異。在輔助生殖妊娠結局的研究中，大多采用χ2檢驗比較組間流產率、臨床妊娠率、活產率等妊娠結局的差異顯著性，往往由于樣本例數較少，雖然百分率存在明顯差異，但統計學卻無顯著性差異，本研究中，常染色體次縊痕區多態組和Y染色體多態組中臨床妊娠率和活產率均低于對照組10%左右，9號染色體臂間倒位組的異常妊娠率則較對照組高近4倍，但χ2檢驗，差異無統計學意義(P>0.05)。此外，如活產率等數據是總活產周期數與總移植胚胎周期數的比值，模糊了每個周期樣本的特性，不利于相關差異因素的發現，因此如采用如Logistic回歸分析這樣的相關性分析方法，則能更準確的發現影響妊娠結局的相關因素。

本研究首次回顧性分析了不同類型男性染色體多態患者IVF/ICSI助孕的臨床結局，同時對采用Logistic回歸分析對造成不同妊娠結局的相關影響因素進行了分析，結果發現9號染色體臂間倒位與異常妊娠的發生呈正相關，常染色體次縊痕區多態和Y染色體多態則與成功活產呈負相關，表明男性9號染色體臂間倒位會增加異常妊娠的發生率，而男方常染色體次縊痕區多態和Y染色體多態則會降低活產率。

9號染色體臂間倒位[inv(9)]是一種較常見的染色體變異，男性9號染色體臂間倒位會形成4種不同的精子，一種為正常染色體，一種為倒位染色體，其余兩種均為帶有部分重復和部分缺失的重排染色體。當含重組染色體的精子與正常卵子受精后，會造成遺傳物質出現缺失或重復，從而造成流產、死胎等生殖異常。不少臨床對照研究認為,在各類型染色體多態性中inv(9)較易引起流產、死胎、后代異常等臨床表現[20]。本研究中也發現inv(9)是引起異常妊娠(早期流產+停止發育)的高危因素，但inv(9)并未對臨床妊娠率及活產率造成影響，這與國內多篇研究報道結果一致[12-14]。

1、9及16 號常染色體次縊痕區異染色體長度增加(qh+)，可造成遠端染色體片段重復，導致同源染色體配對困難，可產生不平衡的配子[11]，同時異染色體長度增加還可能引起相鄰基因的表觀遺傳學改變，甚至導致基因沉默[21]。本研究發現1、9及16號常染色體次縊痕區多態與成功活產呈負相關，顯示其為正常妊娠的不利因素。此外，本研究中雖發現常染色體次縊痕區多態組中異常妊娠率較對照組要高，但差異無統計學意義(P>0.05)，回歸分析也未發現其是異常妊娠發生的正相關因素，此結果與Minocherhomji等[10]的研究結果一致。

Y染色體長臂DNA過多的重復可能影響減數分裂時X-Y配對聯會[22]，此外Y染色體長臂增加可能會抑制與精子分化及發育相關基因的正常表達，導致精子生成障礙并影響精子的受精能力[10,23]。Y染色體中異染色質的缺失則可能致使常染色質排列松散，導致精子生成異常[23]。本研究中，并未發現在Y染色體多態組中正常受精率較對照組有所降低，其原因可能是人工體外受精技術一定程度上彌補Y染色體多態患者精子生成障礙和受精能力低的缺陷。本研究發現Y染色體多態與成功臨床妊娠和活產均呈負相關，顯示其為正常妊娠的不利因素，此結果與一些研究報道相一致[6-7]，但與另一些報道不一致[14-16]，不一致原因可能與統計學方法及這幾項研究的樣本例數較小有關。

D/G組染色體隨體增加可能導致端著絲粒染色體的不分離，造成胚胎發生染色體非整倍性變異，或造成減數分裂中產生異常配子，從而增加流產發生幾率[24]。本研究中雖然觀察到D/G 組染色體隨體多態性組中平均正常受精率和異常妊娠率均較對照組有所降低，但均無統計學意義(P>0.05)，這可能與樣本例數較少有關。此外，本研究未發現D/G 組染色體隨體多態與臨床妊娠結局具有相關性。

綜上，本研究發現，在IVF/ICSI-ET治療中，男性1、9及16號常染色體長臂次縊痕長度變異、9號染色體臂間倒位和Y染色體長臂異染色質區長度變異，均是造成不良妊娠結局的影響因素，男性患者存在這些染色體多態可能增加輔助生殖助孕患者發生不良妊娠的風險。