短短芽孢桿菌GZDF3嗜鐵素合成酶基因Gene5693的生物信息學分析及原核表達*

袁林， 賈化可， 盛淼淼， 王兵， 曾麗娜， 劉紅美，隆耀航**

(1.貴州醫科大學 醫藥生物技術研究中心,貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫科大學 生物與醫學工程重點實驗室,貴州 貴陽 550025；3.貴州省教育廳 免疫細胞與抗體工程研究中心,貴州 貴陽 550025； 4.貴州醫科大學 生物與工程學院， 貴州 貴陽 550025)

在微生物生命活動中，鐵元素參與多種生化代謝過程。鐵在地殼中含量較多，但多以Fe(OH)3形式存在，溶解性差，很難被生物吸收利用[1-2]，因此微生物進化過程中形成了多種途徑來獲取鐵，合成嗜鐵素(Siderophore)就是其中一種非常重要的途徑[3-6]。嗜鐵素是微生物在低鐵或缺鐵應激條件下合成的一種能夠高效結合Fe3+、并將其轉運到細胞內的小分子有機化合物[7]。短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)是革蘭陽性菌，有較強蛋白分泌能力，是一種產芽孢的生物防治菌[8-12]。短短芽孢桿菌GZDF3從半夏根際土壤分離獲得[13]，該菌株對半夏病原菌及多種其它病原菌均具有較強的拮抗作用，在植物病蟲害的防治上具有較好的應用前景，其抗菌成分值得深入研究[14]。本課題組前期的研究發現GZDF3基因組中沒有與Bacillibactin嗜鐵素合成基因簇相似的基因簇，但存在一個與Petrobactin嗜鐵素相似性高達83%的合成基因簇。Petrobactin嗜鐵素合成基因簇asbABCDEF，分別與短短芽孢桿菌GZDF3的Gene5689、Gene5690、Gene5691、Gene5692、Gene5693、Gene5694的6個基因相對應[15]。目前Petrobactin嗜鐵素相關研究多集中于炭疽芽孢桿菌。2004年，有學者通過定向基因敲除研究了asbA基因的功能，缺鐵條件下，asbA缺失突變體表現為嗜鐵素產量降低，長勢變弱[16]。而且，asbA缺失突變體對老鼠的致病力也顯著降低[16]，Nusca等[17]利用檸檬酸、亞精胺、3，4-二羥基苯甲酸底物成功實現了Petrobactin嗜鐵素的異源表達，發現AsbA合成酶的功能可以由AsbB進行補償，即缺失AsbA合成酶，其余5個基因也能合成部分Petrobactin；但是asbE基因缺失，不能合成Petrobactin嗜鐵素，意味著asbE基因是Petrobactin嗜鐵素合成途徑中的關鍵基因。目前，已經對Petrobactin嗜鐵素合成基因簇中的asbB[12]、asbD[13]、asbF[14]進行了功能與結構研究。但對短短芽孢桿菌嗜鐵素的研究尚未見報道，因此，基于asbE在嗜鐵素合成過程中的重要作用，本研究對短短芽孢桿菌GZDF3菌株Petrobactin嗜鐵素合成基因Gene5693(asbE)進行分析，為后續嗜鐵素合成基因簇的功能及體外合成研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

pET-28a質粒的菌種由本課題組保存；表達菌株BL21由生物與工程學院王兵副教授饋贈；短短芽孢桿菌GZDF3由本課題組分離獲得，其全基因組序列登錄號LVYG00000000。

1.2 方法

1.2.1生物信息學分析 (1)嗜鐵素合成酶蛋白的預測，在AntiSMASH(http://antismash.secondarymetabolites.org/)軟件里輸入短短芽孢桿菌GZDF3全基因組序列(登錄號LVYG00000000)，利用AntiSMASH(Ver 3.0.5)預測其代謝產物合成基因簇[18]；利用序列分析軟件BioEdit7.0.9.0構建本地短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)GZDF3蛋白質序列數據庫，以NCBI中檢索到的asbE(登錄號WP_132131835)蛋白質序列作先導序列， blastp搜索BrevibacillusbrevisGZDF3本地蛋白質序列數據庫；(2)嗜鐵素合成酶蛋白基本性質分析，用ExPASy(http://www.expasy.org/)分析預測嗜鐵素合成酶蛋白的等電點(pI)和相對分子質量(MW)、親水性及疏水性，用TMpred軟件進行跨膜區域分析，用SignalP進行信號肽分析。

1.2.2引物設計 利用DNAMAN軟件設計目的基因的引物序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，上游引物序列為 5′-CGTGGATCCATGGTTAAGGTTC-3′，下游引物序列為5′-CGTAAGCTTTTACCTCCACCC-3′，其中下劃部分分別為BamHⅠ和Hind Ⅲ酶的識別切割位點。

1.2.3目的基因的擴增及純化 從-80 ℃冰箱取出菌種GZDF3劃線培養，從過夜培養的平板中挑取邊緣清晰的單菌落放入LB液體培養基中，在搖床中37 ℃振蕩培養過夜；按照細菌基因組DNA提取試劑盒操作步驟，提取GZDF3菌株的基因組；以其為模板進行PCR擴增，產物用3 mol/L NaAc和無水乙醇進行純化。

1.2.4重組質粒的構建及鑒定 將含有pET-28a質粒的E·coli接種于含卡那霉素的LB液體培養基中37 ℃振蕩培養過夜，使用OMEGA公司Plasmid Mini KIT按說明書提取pET-28a質粒并純化；將純化后的PCR產物Gene5693與pET-28a質粒用酶BamHⅠ和Hind Ⅲ 酶切，隨后電泳檢測并回收酶切產物，16 ℃連接過夜；將連接后的質粒轉化到大腸桿菌BL21感受態細胞中培養過夜，隨機挑取5～10個單菌落進行菌落PCR鑒定，選取電泳條帶大小與目的基因一致的菌液進行擴大培養，并進行雙酶切鑒定，將經菌落PCR 和雙酶切鑒定的菌液保存并送深圳華大基因進行測序驗證。

1.2.5重組DNA分子的誘導表達及表達產物的純化 (1)重組DNA分子的誘導表達，將過夜培養的菌液以1% 的接種量進行擴大培養，振蕩培養至OD600為0.5左右，取1 mL作為誘導前對照；加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷IPTG進行誘導表達，于30 ℃ 培養4 h；將誘導表達后菌液低溫離心10 min，取上清1 mL作為誘導后對照；將離心后菌體用適量PBS溶液進行重懸，在冰水浴中進行超聲破碎，破碎后離心收集上清；將誘導前、誘導后，破碎后的樣品與蛋白上樣緩沖液按4 ∶1混合，煮沸并冷卻后點樣；通過考馬斯亮藍染色、脫色后觀察重組蛋白的表達情況。(2)表達產物的純化，將誘導表達并進行菌體超聲破碎后離心收集的上清，通過Ni-NTA.His純化柱進行純化，加入洗雜液，收集液體B1、B2、B3(雜蛋白)；加入洗脫液，收集洗脫液為C1、C2、C3(目的蛋白)；將目的蛋白通過SDS-PAGE電泳檢測。

2 結果

2.1 嗜鐵素合成酶的生物信息學分析

結果顯示，短短芽孢桿菌GZDF3基因組中存在多種編碼次級代謝產物的基因簇，其中一種基因簇編碼產物為嗜鐵素，與文獻[15]報道的Petrobactin嗜鐵素相似性達83%。以炭疽芽孢桿菌Petrobactin嗜鐵素生物合成基因asbE(NCBI登錄號WP_132131835 )與本地GZDF3蛋白質序列數據庫比對，發現其與短短芽孢桿菌基因組的Gene5693基因相對應，通過DNAMAN中的多序列比對結果如圖1A所示，發現Gene5693與AsbE蛋白的氨基酸序列一致性達到51.06%。

2.2 嗜鐵素合成酶Gene5693的基本性質

利用ExpASy數據分析系統ProtParam分析，發現嗜鐵素合成酶基因Gene5693所編碼氨基酸的分子式為C1787H2719N439O511S16，長度為327個氨基酸；分子量為39.05 kDa，理論等電點pI=4.94，為酸性蛋白；不穩定指數為38.04，半衰期為30 h，可初步判定為穩定蛋白。Gene5693有40個正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)，57個負電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)，脂肪系數為88.23；親水性預測結果如圖1B所示，平均親水性為-0.336，初步判定Gene5693蛋白是親水性蛋白質，不含有信號肽和跨膜區域。

注：A為Gene5693與asbE的序列比對結果，B為Gene5693蛋白的親疏性分析。圖1 Gene5693與asbE的序列比對及蛋白的親疏性結果Fig.1 The alignment between Gene5693 and asbE sequences

2.3 目的基因擴增和酶切

以 GZDF3菌株的基因組DNA為模板，經PCR擴增得到目的基因Gene5693，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖2A，在1 000 bp處有一條特別明亮的條帶，大小與預測的相符。

2.4 重組DNA分子的篩選與鑒定

2.4.1菌落PCR鑒定 菌落PCR鑒定結果如圖2B所示，泳道1～5在1 000 bp處都有明亮的條帶，與泳道6(陽性對照)大小一致，初步確定Gene5693基因成功連接到質粒上并轉化成功。

2.4.2雙酶切鑒定及測序驗證 將經菌落PCR檢測陽性的單菌落擴大培養，提取質粒雙酶切后電泳結果如圖2C，泳道1～5為重組質粒雙酶切后電泳條帶，其兩條片段大小分別與空載體pET-28a(泳道6)和Gene5693基因(泳道7)一致，表明Gene5693基因成功連接到載體pET-28a上；同時，測序結果經比對分析表明克隆序列與原序列相同，沒有發生突變，說明重組質粒構建成功，可用于下一步的誘導表達。

注：M:DL2000 Marker，A為Gene5693基因的PCR擴增、1為PCR產物，B為菌落PCR、1～5為隨機挑選的單菌落、6為陽性對照、7為陰性對照，C為重組DNA分子的雙酶切、1～5為質粒雙酶切產物、6為pET-28a、7為酶切后的Gene5693。圖2 Gene5693基因的PCR擴增、菌落PCR及重組DNA分子的雙酶切電泳結果Fig.2 Amplification ,colony PCR and double enzymatic digestion of recombinant of Gene5693

2.4.3嗜鐵素合成酶Gene5693的原核表達及純化 將菌株接種于含0.1 mol/L IPTG的培養基中，30 ℃誘導表達4 h，SDS-PAGE結果如圖3所示，誘導前后上清(泳道1～2)均無目的條帶，誘導表達破碎后上清(泳道3～4)含目的條帶。進一步純化后的目的蛋白(泳道5～8)與預測的理論大小(39.05 kD)一致。

注：M為Marker，1為誘導前上清，2為誘導后上清，3～4為誘導破碎上清， 5～8為純化后的目的蛋白。圖3 表達產物的SDS-PAGE電泳檢測Fig.3 The expression of amplified Gene5693

3 討論

嗜鐵素作為微生物次級代謝產物的其中一種，在醫學、農業、工業及環境保護中都有重要意義。在生物防治方面，嗜鐵素對多種病原菌具有抑制作用，為開發生物農藥具有潛在價值。短短芽孢桿菌GZDF3分離自半夏根際土壤，對尖孢鐮刀菌等多種病原菌有拮抗作用。本課題組通過AntiSMASH對短短芽孢桿菌GZDF3全基因組序列進行分析，發現GZDF3基因組中沒有Bacillibactin嗜鐵素合成基因簇，但存在一個與Petrobactin嗜鐵素相似性高達83%的合成基因簇。相關文獻報道Petrobactin嗜鐵素合成基因家族中asbE基因缺失，不能合成Petrobactin嗜鐵素，證實asbE基因是Petrobactin嗜鐵素合成途徑中的關鍵基因。目前， Petrobactin嗜鐵素合成基因簇中的asbB[12]、asbD[13]、asbF[14]基因已有相關的功能與結構研究，而對asbE基因的報道很少，因此本研究對Gene5693(asbE)基因進行生物信息學分析并構建原核表達載體進行重組表達，發現其與AsbE蛋白序列一致性達到51.06%，可認為其同源。利用ExpASy數據分析系統ProtParam程序分析預測嗜鐵素合成基因的氨基酸序列和相關的理化性質，初步判定Gene5693蛋白是親水性穩定蛋白質。2009年，余賢美等[19]在枯草芽孢桿菌 CAS15 嗜鐵素基因的表達實驗中，用IPTG 在 30 ℃誘導 4 h 實現高效表達，并進行了功能實驗驗證。目前，還未見短短芽孢桿菌中嗜鐵素合成基因的研究。

本研究采用PCR方法克隆了短短芽孢桿菌GZDF3嗜鐵素合成基因Gene5693，進行生物信息學和理化性質分析，短短芽孢桿菌GZDF3基因組中存在多種編碼次級代謝產物的基因簇，其中一種基因簇編碼產物為嗜鐵素，并且與Petrobactin嗜鐵素相似性達到83%，Gene5693與AsbE蛋白的氨基酸序列一致性達到51.06%，編碼的蛋白為酸性蛋白。進一步構建原核表達載體并成功分離純化獲得Gene5693蛋白。

綜上所述，本研究成功克隆了短短芽孢桿菌GZDF3嗜鐵素合成基因Gene5693并構建重組表達載體，并成功誘導表達。這將為進一步研究短短芽孢桿菌GZDF3中嗜鐵素合成基因簇的功能及體外合成研究奠定一定的理論基礎，從而為短短芽孢桿菌GZDF3在促進植物生長和植物病害生物防治中的應用提供參考。