諾米林平衡溶解度和表觀油水分配系數的測定*

郁林娜， 程盛勇， 付洋， 魯文琴， 黃靜， 羅喜榮*， 楊軍

(1.貴州醫科大學 藥學院,貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫科大學附院 藥劑科,貴州 貴陽 550004； 3.中國科學院 地球化學研究所,貴州 貴陽 550081)

諾米林(nomilin)是從桔核中提取分離得到的四環三萜類化合物，系桔核中含量僅次于檸檬苦素(limonin)的主要檸檬苦素類似物甙元[1]。諾米林具有抗腫瘤、抗病毒、抗血管生成、抗增殖活性、抗肥胖、調節糖代謝、抑制破骨細胞分化及免疫調節等作用，諾米林對正常細胞無毒副作用，但其口服吸收差、生物利用度低[2-10]。課題組前期研究發現諾米林水溶性差，其臨床應用受限。藥物的油水分配系數和溶解度與藥物的吸收密切相關，對制劑設計具有重要的指導意義。目前國內外尚未見諾米林平衡溶解度和油水分配系數的研究報道，本文采用搖瓶法[11]和UPLC法[12]測定諾米林在不同介質中的平衡溶解度和表觀油水分配系數，為改善其生物利用度的新劑型的設計提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Agilent 1290 DAD超高效液相色譜儀(美國Agilent公司)、UC-10H加熱超聲波清洗器(上海泰坦科技股份有限公司)、pHS-3C酸度計(上海理達儀器廠)、SHZ-C水浴恒溫振蕩器(上海浦東物理光學儀器廠)、TGL-16G高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)、BSA224S電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)、諾米林(自制，純度大于98%)、乙腈和甲醇(德國默克公司，色譜純)、聚乙二醇400及吐溫-80為化學純，其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1溶液的配制 (1)對照品溶液的配制：精密稱取諾米林11 mg置10 mL量瓶，加甲醇超聲溶解、定容至刻度制得1.1 g/L儲備液。精密量取儲備液適量，采用逐級稀釋法配制4.30、8.59、17.19、34.38、68.75、137.5及275 mg/L系列對照品溶液。(2)緩沖液的配制：取磷酸二氫鉀0.68 g加水適量，以1 mol/L鹽酸或氫氧化鈉調制pH為1.2、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、6.8、7.4及8.0的系列磷酸鹽緩沖液。(3)表面活性劑溶液的配制：分別取吐溫80、聚乙二醇400(PEG400)、十二烷基硫酸鈉(SDS)適量，配制成濃度為5、10、20、40、60及80 g/L的系列水溶液。

1.2.2色譜條件 色譜柱為Ultimate?AQ-C18 (2.1 mm×100 mm,1.8 μm)，流動相為乙腈-水(45 ∶55)，流速為0.3 mL/min，檢測波長為210 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為0.8 μL。在上述色譜條件下，諾米林的保留時間為5.2 min，色譜峰峰形及分離度良好，無雜質峰干擾，見圖1。

圖1 諾米林的UPLCFig.1 UPLC chromatogram of nomilin

1.2.3平衡溶解度的測定 取過量諾米林置西林瓶，分別用移液管移取加入2 mL有機溶劑、水、緩沖液、表面活性劑溶液，37 ℃超聲(260 W，40 kHz)至藥物過飽和，置于同溫度水浴恒溫振蕩器中120 r/min振蕩24 h，以15 000 r/min離心5 min，取上清液，稀釋或濃縮至標準曲線濃度范圍內，0.22 μm微孔濾膜過濾，按上述色譜條件進樣檢測，根據標準曲線計算諾米林在各介質中的平衡溶解度。

1.2.4表觀油水分配系數的測定 取諾米林適量溶于水飽和的正辛醇中，使成飽和態，以15 000 r/min離心5 min。精密吸取上清液0.5 mL于10 mL離心管中，分別用移液管移取加入正辛醇飽和的水、緩沖液各5 mL，置于37 ℃恒溫振蕩器中120 r/min振蕩24 h，以15 000 r/min離心5 min，取上層正辛醇相、下層水相，稀釋至標準曲線濃度范圍內，于0.22 μm微孔濾膜過濾，按上述色譜條件進樣，根據標準曲線計算諾米林的正辛醇相即油相濃度C0和水相濃度CW，按lgP=C0/CW計算油水分配系數。

2 結果

2.1 方法學考察

2.1.1線性關系考察 分別取對照品溶液適量，于0.22 μm微孔濾膜過濾，按色譜條件進樣檢測，記錄峰面積；以諾米林質量濃度X(mg/L)為橫坐標對峰面積Y進行線性回歸，得回歸方程：Y=1.966 7X-2.264 9，R2=0.999 5，結果表明諾米林在4.30～275 mg/L范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.1.2精密度試驗 分別取高、中及低濃度(275、34.38及4.30 mg/L)標準液，于0.22 μm微孔濾膜過濾，按色譜條件1 d內連續進樣檢測5次，記錄峰面積，計算RSD；連續進樣檢測5 d， 1次/d，記錄峰面積，計算RSD。結果其日內RSD分別為0.27%、0.69%及2.34%，日間RSD分別為0.61%、0.61%及2.23%，表明方法的精密度良好。

2.1.3重復性試驗 分別配制高、中及低濃度(275、34.38及4.30 mg/L)標準液各5份，于0.22 μm微孔濾膜過濾，按色譜條件進樣檢測，記錄峰面積，計算RSD。結果其重復性RSD分別為0.78%、1.38 %及1.82 %，表明方法的重復性良好。

2.1.4準確度試驗 分別取高、中及低濃度(275、34.38及4.30 mg/L)標準液，于0.22 μm微孔濾膜過濾，按色譜條件進樣檢測，記錄峰面積，根據標準曲線計算對應的濃度，按準確度為測定濃度值除以真實濃度值計算高、中及低濃度的準確度。結果其準確度分別為104%、96.24%及103.24%，表明方法的準確度良好。

2.2 平衡溶解度

按“1.2.3”項下方法測定諾米林的平衡溶解度，結果表明諾米林不溶于石油醚、正己烷、水及緩沖液，在二氯甲烷中的溶解度最大，SDS對其增溶作用最明顯，見表1、圖2。

表1 37 ℃條件下諾米林在不同介質中的平衡溶解度Tab.1 Equilibrium solubility of nomilin in different media at 37 ℃

圖2 37 ℃條件下諾米林在不同介質中的平衡溶解度Fig.2 Equilibrium solubility of nomilin in different media at 37 ℃

2.3 表觀油水分配系數

按“1.2.4”項下方法測定諾米林的表觀油水分配系數，結果諾米林在正辛醇/水中的表觀油水分配系數為131.05(lgP=2.12)，在正辛醇/磷酸鹽緩沖液中表觀油水分配系數呈M形，在pH 3.0緩沖液中表觀油水分配系數最大為783.07(lgP=2.89)，見圖3。

圖3 諾米林在37 ℃條件下于正辛醇/磷酸緩沖液中的表觀油水分配系數Fig.3 Apparent oil-water partition coefficient of nomilin in octanol/buffer at 37 ℃

3 討論

目前,有關諾米林的報道主要集中在提取分離、藥理作用的研究，鮮見其理化性質的研究報道。本文建立了諾米林含量的UPLC測定方法，測定了諾米林在不同介質中的平衡溶解度和表觀油水分配系數。結果表明諾米林不溶于石油醚、正己烷、水及緩沖液，在二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯中溶解度較大，為中等極性化合物，屬難溶性藥物；諾米林在正辛醇-水/緩沖液中的lgP值為1.77～2.89，ACD/ChemSketch 12.0軟件預測值為2.22±0.78，實測值與理論預測結果相近，提示其在整個胃腸道中均有較好的吸收，適于制成口服制劑。

諾米林水溶性差，其lgP提示膜滲透性好，屬于生物藥劑學分類系統的Ⅱ類藥物。疏水性強不是限制諾米林口服吸收的主要原因(lgP>5的藥物不易吸收)，導致其生物利用度低的原因可能是藥物溶解度小導致藥物溶出速度太慢。因此在諾米林制劑設計時，可考慮采用增溶輔料或固體分散體、納米粒、自微乳等制劑手段提高其溶解度和溶出速率，以提高其生物利用度。口服制劑溶出度的測定一般采用水、pH1.2鹽酸溶液和pH6.8的磷酸鹽緩沖液，諾米林在這3種介質中均達不到漏槽條件。

綜上，本研究了3種表面活性劑對諾米林的增溶效果，其中SDS的增溶作用最大，提示諾米林水溶性差，但滲透性較好，適合制成口服制劑，可以將SDS作為諾米林制劑的溶出介質。