婦科再造丸含藥血清對子宮肌瘤細胞增殖和凋亡的影響*

胡穎， 張晴， 葉蘭， 鄭濤

(1.貴州醫科大學 基礎醫學院 藥理學教研室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫科大學 基礎醫學院 機能學實驗室， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州中醫藥大學第一附屬醫院， 貴州 貴陽 550001)

子宮肌瘤又稱子宮平滑肌瘤，是女性生殖器中最常見的良性腫瘤，臨床常見的癥狀有子宮異常出血、壓迫癥狀、疼痛以及生育能力喪失等，嚴重威脅女性健康[1]。研究表明，子宮肌瘤的發生和發展與子宮平滑肌細胞的過度增殖關系密切[2]。本研究采用細胞生物學與中藥血清藥理學相結合的方法[3]，觀察婦科再造丸(FKW)含藥血清對體外原代培養的子宮肌瘤細胞增殖和凋亡的作用及對其人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)蛋白表達的影響，探討FKW抗子宮肌瘤的作用機理，為FKW臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標本收集 標本取自2015年1月-2017年4月因子宮肌瘤而行子宮全切或肌瘤剔除術的絕經前婦女，患者年齡35～50歲，術前3個月無類固醇激素使用史，術后經病理學診斷為子宮肌瘤。術中無菌條件下取子宮肌瘤組織1 cm3，置于3%雙抗(青霉素、鏈霉素)的PBS 10 mL中，密閉冰浴條件下盡快送入細胞培養室。

1.1.2實驗動物 清潔級3月齡Sprague-Dawley (SD)大鼠，雌性、體質量(200±20) g、合格證號SCXK(黔)2012-0001，由貴州醫科大學實驗動物中心提供。

1.1.3主要試劑與儀器 DMEM培養基(Hyclone)，胎牛血清(Hyclone)，DMSO(Sigma)，胰蛋白酶(Sigma)，MTT(Sigma)，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)；兔抗人平滑肌肌動蛋白單克隆抗體(Abcam)，PTEN抗體、PV6000免疫組化試劑盒及DAB(氨基聯苯胺)顯色試劑盒均購自北京中衫生物技術有限公司。酶標儀(BIO-RAD550型)，BDS200倒置生物學顯微鏡(重慶奧特光學有限責任公司)，流式細胞儀(Guava easyCyte)，CO2恒溫培養箱(上海一恒科技有限公司)，QL-901旋渦振蕩器(海門市麒麟醫用儀器廠)等。

1.1.4藥品 FKW(棕褐色丸劑)每10丸質量2.6 g，貴陽德昌祥藥業有限公司生產，批號20151021，試驗前用蒸餾水配制成高劑量112 g/L；中、低劑量組依次等比稀釋1倍，濃度分別為56 及28 g/L；桂枝茯苓膠囊(GuiZhi Fu Lin Jiao Nang,GZFLJN)，連云港康緣制藥股份有限公司生產，批號150106，臨用前用蒸餾水配制成混懸液30 g/L。

1.2 方法

1.2.1FKW含藥血清的制備 取健康雌性SD大鼠60只，隨機分為無藥血清組，FKW低、中、高劑量組，GZFLJN組，每組12只。每只大鼠灌注：無藥血清組每次灌服生理鹽水10 mL/kg；FKW高、中、低劑量組每次灌服相應藥液10 mL/kg，分別為成人等效劑量12.9倍、6.5倍及3.2倍；GZFLJN組每次灌服相應藥液10 mL/kg，為成人等效劑量6.4倍。各組大鼠給藥2次/d，共3 d，第3天末次給藥1 h后經股動脈取血，3 000 r/min離心20 min，分離血清，56 ℃恒溫30 min滅活補體，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌分裝，-20 ℃保存備用。

1.2.2人子宮肌瘤細胞原代培養及鑒定[4]將肌瘤組織在無菌條件下用3%雙抗PBS液漂洗，在含DMEM培養液中剪碎為約1 mm3的組織塊，每塊間距2～3 mm擺放于培養瓶中，吸出培養液，輕輕翻轉培養瓶使瓶底朝上后加入含10%胎牛血清的DMEM培養液，置于37 ℃、5% CO2培養箱內，4 h后將培養瓶翻正培養，每2～3 d換液1次，約3～4周出現致密細胞層時取出組織塊，細胞生長融合達80%時，胰酶消化傳代。選擇生長良好、形態均一的第3～4代細胞用于后續實驗。傳代細胞均經α-actin(α-平滑肌肌動蛋白)免疫細胞化學法鑒定證實。

1.2.3子宮肌瘤細胞增殖活力檢測 采用MTT比色分析法，將3～4代子宮肌瘤細胞消化成細胞懸液，調整濃度至6×109/L，每孔100 μL接種于96孔板(第一個孔留作空白)，于37 ℃、5% CO2中培養24 h，棄培養基后分別加入FKW低、中、高劑量組及GZFLJN組20%含藥血清處理細胞，以加入20%無藥血清組作為細胞對照，空白孔加入DMEM培養液作為空白對照，各設5個復孔，置正常條件下培養24、48及72 h，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，繼續培養4 h后棄培養液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，震蕩混勻15 min，酶標儀在490 nm處測定吸光度(OD)值。并計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=(1-用藥組OD值/細胞對照組OD值)×100%。

1.2.4子宮肌瘤細胞凋亡檢測 采用Annexin V-FITC/PI雙染色法流式細胞術，將第3～4次傳代培養的子宮肌瘤細胞接種于5個6 cm培養皿(>1×105/皿)，隨機分為細胞對照組、FKW低、中、高劑量組及GZFJN組，置37 ℃，5% CO2培養箱中培養24 h，依實驗分組分別加入相應的20%無藥血清及含藥血清培養液，根據MTT結果采用經過各種藥物干預72 h的子宮肌瘤細胞，加入適量0.25%胰酶消化收集細胞，制備濃度為1×108/L的細胞懸液，取1 mL細胞懸液，離心后去上清液，Annexin V buffer液100 μL重懸，在細胞懸液中分別加入Annexin V-FITC 5 μL避光孵育20 min再加碘化丙啶(PI)染色液5 μL，室溫下避光孵育15 min，流式細胞儀檢測；實驗重復3次。

1.2.5PTEN表達 采用免疫細胞化學法，在6孔板中放上18 mm×20 mm的蓋玻片，肌瘤細胞以1×107/L密度接種，每孔100 μL，按1.2.4項下分組，每組設3個復孔。待細胞貼壁后，加入相應的20%無藥血清及含藥血清培養液作用72 h，吸棄培養液，PBS沖洗3 min×2次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗5 min×3次，山羊血清封閉液孵育10 min，甩去多余液體，滴加一抗，4 ℃過夜，滴加二抗，二氨基聯苯氨顯色液(DAB)顯色，脫水，封片。結果判斷：DAB染色后陽性細胞細胞漿或細胞膜上出現棕黃色顆粒，采用圖像分析軟件計算陽性細胞的平均光密度值。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 人子宮肌瘤細胞原代培養及鑒定

培養第10天開始，組織塊邊緣有細胞游出，后隨時間延長逐漸分裂，最終融合成片。胞體細長，為不規則三角形或梭形，細胞生長呈放射狀或旋渦狀。α-actin單克隆抗體免疫細胞化學染色證實培養的子宮肌瘤細胞在傳代過程中始終保持平滑肌特性，肌瘤細胞純度高，陽性細胞數接近100%，可用于后續的實驗研究。

2.2 FKW含藥血清對子宮肌瘤細胞增殖的影響

結果顯示(見表1和圖1)，FKW含藥血清各劑量組干預24、48及72 h，各給藥組OD值均較細胞對照組明顯下降(P<0.05，或<0.01)，在同一時間點，隨著FKW濃度的增加，其增殖抑制作用逐漸增強，細胞增殖抑制率逐步升高(P<0.05，或<0.01)；同一藥液濃度下，各組作用72 h的抑制效應較作用24、48 h顯著增強(P<0.05，或<0.01)，顯示呈劑量和時間依賴性。因此，在后續研究中選取72 h為研究的有效作用時間點。

圖1 藥物對子宮肌瘤細胞的抑制率Fig.1 Drug inhibition rate of uterine leiomyoma cells

表1 FKW含藥血清對子宮肌瘤細胞增殖的影響(n=5)Tab.1 Effects of FKW medicated serum on proliferation of human uterine leiomyoma cells

注：與細胞對照組比較,(1)P<0.05，(2)P<0.01；與FKW低劑量組比較,(3)P<0.01,(4)P<0.05；與FKW中劑量組比較,(5)P<0.05，(6)P<0.01；與24h處理組比較,(7)P<0.01,(8)P<0.05；與48h處理組比較,(9)P<0.05。

2.3 FKW含藥血清對子宮肌瘤細胞凋亡率的影響

流式細胞儀檢測顯示，細胞對照組未見明顯細胞凋亡，FKW含藥血清各劑量組細胞凋亡率均顯著高于細胞對照組(P<0.01)，且子宮肌瘤細胞凋亡率隨著濃度的增高逐步增高，呈遞增趨勢，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

注：(1)與細胞對照組比較, P<0.01；(2)與FKW低劑量組比較,P<0.01；(3)與FKW中劑量組比較， P<0.01。圖2 FKW對子宮肌瘤細胞凋亡率的影響Fig.2 Effect of FKW medicated serum on apoptosis rate of uterine leiomyoma cells

2.4 FKW含藥血清對子宮肌瘤細胞PTEN表達的影響

免疫細胞化學結果顯示，PTEN蛋白陽性染色定位于平滑肌細胞質，呈棕黃色。FKW低、中、高劑量含藥血清分別作用于子宮肌瘤細胞72 h時，均顯著提高了PTEN蛋白的表達(P<0.01)，其中FKW高劑量組上調PTEN表達作用最為顯著，與FKW低、中劑量組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2、圖3。

表2 FKW含藥血清對子宮肌瘤細胞PTEN表達的影響(光密度,Tab.2 Effect of FKW medicated serum on the expression of PTEN protein of uterine leiomyoma cells

注：(1)與細胞對照組比較,P<0.01；(2)與FKW低劑量組比較,P<0.01；(3)與FKW中劑量組比較，P<0.01。

圖3 各組子宮肌瘤細胞PTEN表達(免疫細胞化學染色，×100)Fig.3 Expression of PTEN protein detected by immunocytochemical staining

3 討論

中醫學認為子宮肌瘤屬“積聚”、 “癥瘕”等范疇，其病機以血瘀為主，瘀血是癥瘕形成的重要因素和關鍵環節。FKW由當歸、白芍、三七、丹參、益母草等42味中藥組成，丹參破血去瘀，行氣止痛；當歸、三七補血、活血、止痛，白芍滋養陰血；全方合用能起消瘤散結、活血去瘀、理氣消滯、清熱解毒之功。FKW的臨床反饋提示其對子宮肌瘤有一定療效[5]，本課題組的前期研究亦表明，FKW對于雌、孕激素誘發的大鼠子宮平滑肌瘤樣增生有顯著的抑制作用[6]。

子宮肌瘤的發病機制復雜，與子宮平滑肌細胞過度增殖密切相關。本研究通過體外培養人子宮肌瘤細胞，建立子宮肌瘤細胞原代培養并傳代，且保持良好的細胞形態和生化特點。在培養的子宮肌瘤細胞中應用FKW含藥血清后發現：FKW含藥血清以劑量-時間依賴性方式抑制子宮肌瘤細胞增殖，以FKW高劑量組作用72 h時抑制增殖作用最為顯著；FKW含藥血清干預72 h后，各給藥組細胞凋亡率顯著高于細胞對照組(P<0.01)，且隨藥物濃度增加呈遞增趨勢。上述研究表明FKW含藥血清可抑制子宮肌瘤細胞的增殖，促進子宮肌瘤細胞凋亡，加速細胞凋亡過程，進而控制肌瘤的生長。

PTEN是一種具有磷酸酶活性的抑癌基因[7]，其產物PTEN蛋白具有脂質磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性，可通過拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性而抑制腫瘤的發生發展[8-9]。磷酯酰肌醇-3-激酶(phosphatidyrlinositol-3-kinase，PI3K)/Akt信號通路是由PI3K家族與其下游的直接靶蛋白絲/蘇氨酸蛋白激酶Akt或蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)組成，是重要的凋亡抑制通路，在調控腫瘤細胞的增殖、分化、存活和遷移等方面發揮作用[10]。PI3K/Akt信號通路的激活，可能通過調節其下游凋亡基因如bcl-2家族的活性、激活其下游分子Mtor、抑制糖原合成酶3的活性等機制而導致細胞存活及增殖，并保護細胞逃避凋亡[11-12]。PTEN的主要作用是對該通路產生負調控，實驗證實，PTEN主要是通過其脂質磷酸酶活性作用于PI3K的下游靶分子三磷酸磷酯酰肌醇 (phosphatidylinosital triphosphate,PIP3)，從PIP3的3’去除磷酸將其轉變成二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositalbiphosphate,PIP2)，使Akt無法活化從而阻斷PI3K/Akt信號通路的抗凋亡作用[13]。多種腫瘤中都可檢測到PTEN的表達減少或缺失。有學者通過免疫組化的方法發現PTEN在正常子宮肌層中高表達，在子宮肌瘤組織中表達強度顯著降低[14]，故認為PTEN在正常子宮肌層中通過阻斷PI3K/Akt通路促進細胞正常凋亡，抑制細胞增殖；而在子宮肌瘤組織中由于表達降低而失去了對此通路的抑制，無法發揮其對細胞生長增殖的負性調節作用，因此促進了子宮肌瘤的發生發展。本研究發現，與細胞對照組比較，FKW含藥血清各劑量組均能不同程度提高子宮肌瘤細胞PTEN表達(P<0.01)。

綜上，本研究發現FKW含藥血清抑制增殖和促進凋亡的作用可能是通過上調PTEN的表達，進而抑制PI3K/Akt信號通路的過度活化而實現的，其具體的作用機制需進一步深入研究。