長(zhǎng)鏈非編碼RNA ITGβ2-AS1對(duì)胰腺癌MAPK信號(hào)通路的作用及機(jī)制*

陳世裕，喻超，潘耀振，陳玲，李琳，楊哲豪，呂彥霖，鄧路，孫誠(chéng)誼**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 肝膽外科，貴州 貴陽(yáng) 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué) 肝膽胰脾重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004；4.貴州省肝膽胰脾疾病研究所，貴州 貴陽(yáng) 550004)

胰腺癌(pancreatic cancer,PC)是惡性程度極高、進(jìn)展迅速及預(yù)后極差的腫瘤，目前治療PC最有效的方式為早期手術(shù)切除[1-2]，但全球PC死亡率一直居高不下，5年生存率僅7%[3-4]。PC診斷及治療的困難與腫瘤細(xì)胞的增殖速度快和轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)密切相關(guān)[5]，因此，尋找更為有效的治療方案成為當(dāng)前PC研究的關(guān)鍵。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是長(zhǎng)度>200 nt、但不具有編碼蛋白質(zhì)功能的一類RNA[6-7]。研究認(rèn)為L(zhǎng)ncRNA在腫瘤的侵襲及遷移過(guò)程中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能[8-10]。LncRNA在各種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所起到的作用不斷被發(fā)現(xiàn)，有望成為臨床診療的新方向。Prensner等[11]發(fā)現(xiàn) LncRNA SChLAP1 在前列腺癌中表達(dá)上調(diào)，與患者生存呈負(fù)相關(guān)，其可能通過(guò)影響染色體重塑促進(jìn)前列腺癌的侵襲及遷移。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路是介導(dǎo)PC細(xì)胞增殖、侵襲及遷移功能的一條關(guān)鍵信號(hào)通路[12-14]，可被細(xì)胞因子及細(xì)胞黏附因子等激活，將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)最終轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)進(jìn)而影響細(xì)胞功能[15-16]，研究發(fā)現(xiàn)LncRNA可能在MAPK信號(hào)通路中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用[17-18]。然而，LncRNA 整合素β2(ITGβ2)-AS1是否能調(diào)控MAPK信號(hào)通路下游相關(guān)靶基因以實(shí)現(xiàn)其功能仍不清楚，因此，在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，本研究利用癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)分析ITGβ2-AS1可能發(fā)揮的細(xì)胞學(xué)功能和參與的信號(hào)通路、分析ITGβ2-AS1與人PC細(xì)胞株P(guān)ANC-1細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路的調(diào)控關(guān)系，以進(jìn)一步闡明其在PC的增殖、侵襲及遷移過(guò)程中的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑

人PC細(xì)胞株P(guān)ANC-1細(xì)胞株為中山大學(xué)腫瘤防治中心惠贈(zèng)，胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(TRYPSIN)、DMEM及RPMI-1640培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)gibco公司，RNA提取試劑Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，BCL2、MMP9及MYC等引物購(gòu)自Sangon Biotech公司，相應(yīng)Western blot一抗購(gòu)自proteintech公司，ITGβ2-AS1-sh購(gòu)自RIBOBIO公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix ExTaq試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1生物信息學(xué)分析 利用cBioPortal網(wǎng)站在線分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.cbioportal.org/)，選擇胰腺導(dǎo)管腺癌數(shù)據(jù)庫(kù)PAAD，數(shù)據(jù)類型選擇mRNA表達(dá)譜，根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果，選取與ITGβ2-AS1相關(guān)的基因中相關(guān)系數(shù)較大(Person系數(shù)>0.6)的基因進(jìn)行GO富集分析，包括細(xì)胞組成(cellular component,CC)、生物過(guò)程(biological process,BP)及分子功能(molecular function,MF)分析。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 人PC細(xì)胞株P(guān)ANC-1使用含10%FBS及1%青-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、含5% CO2的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，分為ITGβ2-AS1干擾對(duì)照組(Negative Control組)及ITGβ2-AS1干擾組(ITGβ2-AS1-sh組)。

1.2.3mRNA表達(dá) 選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC-1細(xì)胞，提取其總RNA，分別測(cè)量A260/A280時(shí)的吸光度，選取吸光度值在1.8～2.0的樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。依照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明，分別將樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再選擇GAPDH作為內(nèi)參，使用SYBR Premix ExTaq試劑盒進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)。

1.2.4蛋白表達(dá) 選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC-1細(xì)胞，提取其總蛋白，根據(jù)蛋白定量結(jié)果點(diǎn)樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵一抗、洗膜、孵二抗、洗膜、曝光，用Image Lab軟件分析所得條帶的灰度值，檢測(cè)各相關(guān)指標(biāo)的蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 ITGβ2-AS1的生物學(xué)功能

根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果，選取與ITGβ2-AS1相關(guān)的基因中相關(guān)系數(shù)較大(Person系數(shù)>0.6)的基因進(jìn)行GO富集分析。CC分析結(jié)果顯示：ITGβ2-AS1可能負(fù)調(diào)控細(xì)胞凋亡過(guò)程，正調(diào)控GTP酶活性和各信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)MAPK信號(hào)通路(圖1A)； BP分析結(jié)果顯示ITGβ2-AS1可能存在于細(xì)胞膜外區(qū)域、外泌體及高爾基體膜區(qū)域(圖1B)， MF分析結(jié)果顯示ITGβ2-AS1可能與氧轉(zhuǎn)運(yùn)體活性、離子通道結(jié)合及RAS活性調(diào)控等功能相關(guān)(圖1C)，提示ITGβ2-AS1可能與PC的增殖及相關(guān)腫瘤信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)。

圖1 GO富集分析ITGβ2-AS1的生物學(xué)功能Fig.1 GO enrichment analysis of the biological function of ITGβ2-AS1

2.2 ITGβ2-AS1的下游信號(hào)通路

根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果，選取與ITGβ2-AS1相關(guān)的信號(hào)通路中相關(guān)系數(shù)位于前12的信號(hào)通路進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：多條信號(hào)通路與PC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程顯著相關(guān)，如癌癥信號(hào)通路(Pathways in cancer)、鈣信號(hào)通路(Calcium signaling pathway)、MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)及缺氧誘導(dǎo)因子1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)等(圖2)；提示ITGβ2-AS1可能參與多條癌癥信號(hào)通路如MAPK信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)控。

圖2 生物信息學(xué)分析ITGβ2-AS1的下游信號(hào)通路Fig.2 KEGG analysis of ITGβ2-AS1-associated signaling pathway

2.3 對(duì)MAPK信號(hào)通路靶基因表達(dá)的影響

生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示：ITGβ2-AS1可能與MAPK信號(hào)通路靶基因BCL2、MMP9及MYC的表達(dá)顯著相關(guān)且存在共表達(dá)的關(guān)系(圖3A)；qPCR結(jié)果(圖3B)表明與干擾對(duì)照組比較，ITGβ2-AS1干擾組PANC-1細(xì)胞BCL2、MMP9及MYCmRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)；這些結(jié)果提示ITGβ2-AS1可能正調(diào)控MAPK信號(hào)通路靶基因的表達(dá)。

注：(1)與Negative Control組比較，P<0.05。圖3 ITGβ2-AS1對(duì)MAPK信號(hào)通路靶基因表達(dá)的影響Fig.3 Effect of ITGβ2-AS1 on the expression of target genes of MAPK signaling pathway

2.4 ITGβ2-AS1對(duì)MAPK信號(hào)通路活性的影響

如圖4所示，ITGβ2-AS1干擾組PANC-1細(xì)胞總ERK1/2蛋白表達(dá)水平與干擾對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而磷酸化的ERK1/2蛋白表達(dá)水平則顯著低于干擾組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示ITGβ2-AS1可能通過(guò)調(diào)控ERK1/2的磷酸化水平從而影響MAPK信號(hào)通路的活性。

注：(1)與Negative Control組比較，P<0.05。圖4 ITGβ2-AS1對(duì)MAPK信號(hào)通路活性的影響(Western blot)Fig.4 Effect of ITGβ2-AS1 on the activity of MAPK signaling pathway

3 討論

PC由于其發(fā)病過(guò)程隱匿、進(jìn)展迅速、早期診斷及手術(shù)切除困難導(dǎo)致治療效果不佳。近年來(lái)，盡管各種治療方法不斷完善，但PC患者的 5 年生存率仍低于7%，其重要原因之一就是其侵襲能力極強(qiáng)[4-5]。

整合素蛋白家族 (integrin family,ITG) 是廣泛分布于細(xì)胞表面的四類細(xì)胞黏附分子之一，是由α和β兩個(gè)亞基組成的異源二聚體跨膜蛋白整合素家族，可以改變腫瘤的增殖、侵襲及遷移等多種生物學(xué)功能[19-20]。其中，ITGβ2主要在各種白細(xì)胞的表面表達(dá)，并能夠與腫瘤細(xì)胞表面的黏附分子結(jié)合，從而賦予腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力[21-22]。有研究報(bào)道，長(zhǎng)鏈非編碼RNA ITGβ2-AS1起源于ITGβ2的啟動(dòng)子，LncRNA ITGβ2-AS1通過(guò)上調(diào)ITGβ2的表達(dá)從而促進(jìn)乳腺癌的侵襲和遷移[23],并在骨肉瘤的增殖和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[24]。LncRNA的表達(dá)失常與包括惡性腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]。然而，對(duì)于 LncRNA 在腫瘤中所起到的作用目前尚處于初步探索階段，特別是對(duì)LncRNA ITGβ2-AS1在PC的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中所發(fā)揮的作用更是知之甚少，因此，進(jìn)一步深入研究其發(fā)揮作用的分子機(jī)制有助于為臨床提供更為有效的治療措施。

細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK1/2)是MAPK信號(hào)通路的重要成員之一，是將信號(hào)從細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和癌變等多種生物學(xué)反應(yīng)[25-26]，其因在激活的生長(zhǎng)因子受體與基因表達(dá)的變化中的作用最為人們所熟知，激活的ERK1/2進(jìn)入細(xì)胞核并磷酸化轉(zhuǎn)錄因子；ERK1/2也可轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核小體及高爾基體和線粒體等其他細(xì)胞器激活特定的底物從而影響細(xì)胞的生理過(guò)程[27-28]。然而，目前對(duì)于LncRNA在PC細(xì)胞ERK1/2的磷酸化激活過(guò)程中的調(diào)控方式仍不完全清楚。本研究先通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)ITGβ2-AS1可能與PC的增殖及相關(guān)腫瘤信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)，并可能參與下游MAPK信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)控；通過(guò)相關(guān)性分析及qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示ITGβ2-AS1可顯著調(diào)控MAPK信號(hào)通路中與PC細(xì)胞增殖、侵襲及異常代謝顯著相關(guān)的靶基因BCL2、MMP9及MYC的表達(dá)，推斷ITGβ2-AS1可能激活MAPK信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)控下游的靶基因。最后通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證上述推斷，結(jié)果提示ITGβ2-AS1可顯著影響ERK1/2的磷酸化水平，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路的作用。

綜上所述，本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析并結(jié)合相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，ITGβ2-AS1在PC細(xì)胞相關(guān)腫瘤信號(hào)通路——MAPK信號(hào)通路的激活過(guò)程中發(fā)揮重要作用，ITGβ2-AS1通過(guò)調(diào)控MAPK信號(hào)通路中關(guān)鍵分子ERK1/2的磷酸化水平，進(jìn)而調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。課題組今后將進(jìn)一步通過(guò)相關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)及臨床樣本信息深入探討ITGβ2-AS1介導(dǎo)MAPK信號(hào)通路激活在PC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的具體分子機(jī)制及臨床意義，為發(fā)現(xiàn)可能針對(duì)PC治療的新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。