卷曲霉素抗結(jié)核作用及耐藥機制的研究進展

官政燕，劉 梅，陳 玲

結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)感染引起的慢性呼吸道傳染病，是全球十大死亡原因之一。目前，耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB，即MTB至少對利福平和異煙肼同時耐藥)及廣泛耐藥結(jié)核病(extensively drug-resistant, XDR-TB，即MTB不僅對利福平和異煙肼同時耐藥，也對氟喹喏酮類藥物中任何一種藥物以及3種二線抗結(jié)核注射藥物卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星中至少1種具有耐藥性)的出現(xiàn)和傳播，對全世界結(jié)核病的有效控制構(gòu)成重大威脅。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)估計，2017年全球新發(fā)結(jié)核病1 000萬例，MDR-TB占46萬，其中約8.5%的MDR-TB患者為XDR-TB[1]。全國第5次結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查報告結(jié)果顯示，我國結(jié)核病總耐藥率高達36.8%，耐多藥率為6.8%[2]。適當使用二線注射藥物(卡那霉素、阿米卡星或卷曲霉素)有助于治療MDR-TB和預防XDR-TB[3]。卷曲霉素(Capreomycin, CPM)是一種環(huán)肽類抗生素，被認為是治療MDR和MTB潛伏感染的關(guān)鍵二線注射類藥物[3-4]，其主要作用機制是干擾核糖體的功能，抑制蛋白質(zhì)的合成[5-7]。然而，隨著臨床上越來越多的使用，CPM耐藥問題逐步浮現(xiàn)，研究發(fā)現(xiàn)CPM耐藥性主要與其作用靶點相關(guān)基因的突變有關(guān)[8-16]。因此，深入了解CPM的作用機制及耐藥機制,有助于指導臨床合理用藥,延緩其耐藥性的傳播以及有效防治MDR-TB。

本文就CPM治療結(jié)核病的作用機制、耐藥機制及相關(guān)基因突變的研究進展進行綜述，以期為CPM的臨床應用提供參考依據(jù)，促進耐藥基因檢測技術(shù)的發(fā)展和加速抗結(jié)核新藥物的開發(fā)進程。

1 抗菌作用機制

CPM于1979年應用于抗結(jié)核治療，是治療耐多藥結(jié)核病的重要二線藥物，對非復制MTB也有殺菌作用[4]。其主要抗菌作用機制是干擾核糖體功能，從而抑制蛋白質(zhì)的合成；還可通過改變細菌細胞壁的結(jié)構(gòu)，影響生物膜的發(fā)育；此外，還與金屬離子協(xié)同作用發(fā)揮其抗菌活性。

1.1抑制蛋白質(zhì)的合成 研究發(fā)現(xiàn)CPM通過tlya的甲基化作用結(jié)合到23S rRNA螺旋H69的核苷酸C1409區(qū)域和16S rRNA螺旋H44的核苷酸C1920區(qū)域之間形成的亞基間橋b2a上，影響細菌核糖體蛋白質(zhì)的合成[11]。研究表明當表達不同的tlya同源物(tlyaI或II)時，大腸桿菌重組體對CPM的敏感度不同，其具體機制有待進一步研究[6]。近期研究顯示，tlya能與s-腺苷-甲硫氨酸(S-Adenosyl-L-Methionine, SAM)結(jié)合，發(fā)揮其甲基化作用，加強MTB對CPM的敏感性[5]。MTB核糖體蛋白L12和L10是50S核糖體的組成部分，在翻譯過程中L12-L10與伸長因子EF-G和EF-Tu的結(jié)合使GTP酶活性增強，使核糖體蛋白質(zhì)合成增加[17]。研究表明CPM能干擾L12-L10的相互作用，破壞其與伸長因子EF-G和EF-Tu的結(jié)合，削弱GTP酶的活性，導致核糖體依賴的蛋白質(zhì)合成受阻，還發(fā)現(xiàn)L10和(或)L12的過表達能降低CPM的抗菌活性，因此推測核糖體蛋白L12和L10很可能是CPM在體內(nèi)作用的新靶點[7]。

1.2改變細菌細胞壁的結(jié)構(gòu)、影響生物膜的發(fā)育 SirR是由Rv2788編碼的一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，研究發(fā)現(xiàn)Rv2788能下調(diào)CPM耐受相關(guān)基因(Rv0039,Rv0812,Rv1286)的轉(zhuǎn)錄，增強恥垢分枝桿菌對CPM的敏感性，而這些基因多與細胞壁相關(guān)。因此，推測SirR可能通過調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，進而改變細胞壁結(jié)構(gòu)，調(diào)控對CPM的敏感性[18]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)噬菌體swu1 A321_gp67(一種假定的gtp酶激活蛋白)過表達使重組恥垢分枝桿菌對CPM等抗細菌藥物極其敏感，進一步研究發(fā)現(xiàn)gp67過表達能引起細胞壁和生物膜發(fā)育相關(guān)基因MSMEG_0235,MSMEG_6092,MSMEG_1876和MSMEG_0382的表達下調(diào)，從而改變恥垢分枝桿菌的細胞壁結(jié)構(gòu)，破壞生物膜的形成。因此，推測gtp酶激活區(qū)可能起一定作用，且提出gp67可以作為一種增效劑加入到現(xiàn)有的抗生素方案中，以更好地控制MTB的耐藥菌株，然而，噬菌體組分如何抑制這些基因的轉(zhuǎn)錄目前還不清楚[19]。

1.3CPM與金屬離子的協(xié)同作用 CPM富含氮的多肽結(jié)構(gòu)使其能與其他金屬離子特異結(jié)合，特別是銅離子，被認為是一種Cu2+的螯合劑[20]，通過對銅-CPM復合體的研究發(fā)現(xiàn)，Cu2+能夠影響分子的極性，將Cu2+附著在藥劑上可以阻止其與多余的氫鍵及蛋白質(zhì)中的無關(guān)陽離子的結(jié)合，在適宜的pH條件下，銅-CPM復合體組比純CPM組對MTB的抗菌活性提高250倍。因此，認為可將Cu2+作為CPM等抗生素的載體[21]。

2 耐藥機制

現(xiàn)有的研究普遍認為CPM的耐藥機制主要是tlya、rrs基因發(fā)生突變導致藥物作用靶點的改變。此外，eis的突變也可導致CPM耐藥。已有報道CPM與氨基糖苷類藥物之間存在交叉耐藥性[12,22-24]。

2.1tlya基因 研究發(fā)現(xiàn)tlya通過調(diào)節(jié)細菌核糖體的甲基化，增強CPM的抗菌作用[6,11]，而tlya基因的突變使核糖體缺少了甲基化，導致耐藥性的產(chǎn)生[10-11]。通過體外誘導tlya基因的突變位點為野生型，可恢復耐藥菌株對 CPM的敏感性[10]，在大腸桿菌中重組tlya的表達明顯增加對CPM的敏感性[11]，驗證了tlya基因突變導致CPM耐藥的發(fā)生。tlya突變主要導致CPM低水平耐藥[13]，可引起CPM和紫霉素交叉耐藥[22]，突變位點見表1。但以往報道的tlya突變主要存在于體外篩選的耐藥突變株中[8,10]，在MTB臨床分離株中，tlya突變并不常見[8,10,22]，而且CPM敏感的臨床分離株中也存在該基因突變[22-23,25]，表明tlya并非MTB臨床分離株對CPM耐藥的敏感標記[22]。多聚磷酸鹽/ATP依賴性NAD激酶(Polyphophate /adenosine triphosphate (ATP)-dependent NAD kinase，ppnK)是MTB生長的必需基因[26]，有研究通過構(gòu)建恥垢分枝桿菌轉(zhuǎn)座子突變體文庫，分離到一個抗CPM的突變體c4，測序發(fā)現(xiàn)c4在tlya和ppnk之間重疊區(qū)發(fā)生了A到G的替換，提示tlya和ppnk重疊區(qū)突變可能與CPM耐藥有關(guān)，但其機制有待進一步闡明[27]。

2.2rrs基因rrs基因編碼16S rRNA，該基因突變導致CPM作用靶點的改變，使其失去對MTB的作用，從而產(chǎn)生耐藥[8-9]。其中最常見的是A1401G突變[13,28]，但有些研究用大腸桿菌16S rRNA基因中的1408位點表示[29]。據(jù)計算，A1401G突變占CPM耐藥比例的76%[30]，其突變可導致CPM與卡那霉素或阿米卡星交叉耐藥[22-24,28,31]，但該突變的臨床耐藥株對CPM的最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)存在較大差異(表1)，且該突變也存在于CPM敏感株中[9,12,22,31]。對于MIC值的差異，推測有以下兩點原因：1.不同的藥物敏感試驗(Drug Susceptibility Testing, DST)方法和標準之間判定的DST結(jié)果差異較大，可能出現(xiàn)錯誤的易感結(jié)果[32]；在CPM耐藥性的檢測中，MGIT960系統(tǒng)DST結(jié)果與A1401G突變的一致性更好，高于瓊脂比例法的檢測[32-33]。2.可能存在第二個位點或基因表達狀態(tài)的改變，從而產(chǎn)生協(xié)同或拮抗作用[9,34],如tlya表達增加時，該突變的抗性降低[35]。rrs基因的其他突變位點見表1。據(jù)報道C1402T和G1484T位點突變普遍導致MTB對CPM高度耐藥，且與交叉耐藥有關(guān)[28,31]。C517T突變導致CPM中度至高度耐藥(MIC,20～80 μg/mL)[8]。最近，在rrs基因中發(fā)現(xiàn)一個新的突變G878A，含G878A的突變株其CPM的MIC為8～64 μg/mL，該作者推測G878A突變是CPM耐藥的新機制，并提出在新分子檢測中加入G878A可提高CPM耐藥檢測的靈敏度，同時該研究發(fā)現(xiàn)這一突變與歐美x3型MTB有關(guān)[15]。

2.3eis啟動子 研究發(fā)現(xiàn)eis突變與低水平的CPM耐藥有關(guān)[13-15]，也可導致CPM交叉耐藥[14]，目前報道的突變位點見表1。G10A突變相對常見，但已有研究發(fā)現(xiàn)在敏感株中也存在該突變[22]，推測eis和CPM之間的相互作用可能受到MTB個體化因素的影響[13]。

2.4其他 除上述3個CPM耐藥相關(guān)基因外，研究發(fā)現(xiàn)在MTB和大腸桿菌中23S rRNArrl基因A1916的缺失導致CPM耐藥[11]，隨后發(fā)現(xiàn)，在嗜熱桿菌(Thermusthermophilus)中23S rRNA螺旋H69的3個突變(A1913U 、mU1915G △mU1915)也引起CPM的耐藥[16]。此外，rpsL基因突變也可引起CPM耐藥(表1)，且CPM的耐藥率在不同地區(qū)存在差異[36-37]。

表1 CPM相關(guān)基因突變頻率
Tab.1 Mutation frequency of capreomycin related gene

基因突變位點(堿基)耐藥株中突變頻率敏感株中突變頻率耐藥株MIC值敏感株MIC值DST方法參考文獻rrsA1401G13/15(0.87)5/49(0.10)5-20 μg/mL≤2.5 μg/mLMABA(微孔板AlamarBlue)[31]G10A1/15(0.07)0/49(0)5 μg/mL/A514C2/15(0.13)7/49(0.14)5 μg/mL1.25 μg/mLG1176A1/15(0.07)0/49(0)5 μg/mL/T15G0/15(0)1/49(0.02)/1.25 μg/mLA278G0/15(0)2/49(0.04)/1.25 μg/mLA207G0/15(0)1/49(0.02)/≤2.5 μg/mLrpsLA128G8/15(0.53)24/49(0.49)≤20 μg/mL≤2.5 μg/mLA263G2/15(0.13)7/49(0.14)5 μg/mL≤2.5 μg/mLA263T1/15(0.07)0/49(0)5 μg/mL/rrsA1401G5/40(0.125)1/30(0.03)//比例法[23]A513C 1/40(0.025)3/30(0.10)//tlyaG176A1/40(0.025)0/30(0)//TT479UA1/40(0.025)0/30(0)//de15341/40(0.025)0/30(0)//Ins683A1/40(0.025)0/30(0)//Ins471T1/40(0.025)0/30(0)//A551U1/40(0.025)0/30(0)//表1(續(xù))基因突變位點(堿基)耐藥株中突變頻率敏感株中突變頻率耐藥株MIC值敏感株MIC值DST方法參考文獻rrsA1401G6/10(0.6)1/128(0.01)//比例法[24]rrsG878A16/92(0.17)/8-64 μg/mL/MABA(MGIT 960 system)[14]eis24/92(0.26)///tlya2/92(0.02)///rrsA1401G20/28(0.71)1/1266(0)8-64 μg/mL4 μg/mL紙片擴散法[25]tlyaT539G2/28(0.07)/>64 μg/mL/Ins49GC1/28(0.04)/>64 μg/mL/A33G27/28(0.96)1/1266(0)8->64 μg/mL4 μg/mLrrsA1401G6/12(0.5)/20-80 μg/mL/MABA[12]C517T1/12(0.08)/40 μg/mL/eisG10A1/12(0.08)/10 μg/mL/tlyaC665G1/12(0.08)/20 μg/mL/G643C1/12(0.08)/5 μg/mL/rrsA1401G41/99(0.41)/5-≥40 μg/mL/MABA(微孔板AlamarBlue)[28]G1484T3/99(0.03)/20-≥40 μg/mL/C1402T2/99(0.02)/≥40 μg/mL/A514C41/99(0.41)/≥40 μg/mL/rrsA1401G74/86(0.86)6/11(0.55)//絕對濃度法[11]

注： / 表示原文無數(shù)據(jù)

3 展 望

CPM是治療耐多藥結(jié)核病的二線藥物，目前對其作用機制及耐藥機制的研究已取得一定的進展。大多數(shù)的研究認為CPM主要通過抑制蛋白質(zhì)合成、影響細胞壁的功能等發(fā)揮其抗結(jié)核分枝桿菌作用,其耐藥性的產(chǎn)生主要與rrs、tlya、eis等基因的突變有關(guān)，但其具體的作用及耐藥機制還有待進一步研究，如核糖體蛋白L12和L10、tlya和ppnk重疊區(qū)的突變是通過何種途徑影響CPM的抗菌活性目前仍不清楚。本文對CPM相關(guān)基因的突變頻率進行了統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)其耐藥所涉及的相關(guān)基因其突變范圍較廣泛、突變頻率較低、MIC值變化較大，目前還難以確定CPM耐藥性檢測的敏感分子標記，且不同的DST檢測方法之間存在差異，目前尚缺乏統(tǒng)一標準，具體檢測方法還有待進一步統(tǒng)一；此外，已有報道在CPM耐藥株中未檢測到當前發(fā)現(xiàn)的突變位點，提示可能存在其他的耐藥機制，需要進行更深入的研究以驗證當前的研究結(jié)果，并探索其作用的新機制。對CPM的作用及耐藥機制的深入研究可能為耐藥基因檢測技術(shù)的發(fā)展和指導臨床合理用藥提供新的思路和方法，為結(jié)核病及耐藥結(jié)核病的診斷提供更科學有力的支撐。

利益沖突：無