旋毛蟲感染早期小鼠腸道病理變化及免疫調節相關細胞因子表達的研究

宋伊寧,徐 靜,龐建達,王昕蕊,劉曉雷,劉明遠,孫樹民，

旋毛蟲是一種雌雄異體線蟲，可感染包括人類在內的所有哺乳動物、部分食肉鳥類及爬行動物，能夠引發嚴重的人獸共患傳染病，對人類和動物健康、社會及經濟發展產生極大負面影響[1]。盡管旋毛蟲病在歐洲和美國得到良好控制,但在中國、阿根廷和東歐等發展中國家和發達國家仍有流行[2]。研究[3]發現旋毛蟲入侵宿主機體不是簡單的機械性滲透的結果[4]。盡管旋毛蟲的感染可誘導機體產生抗體等獲得性免疫效應，但是這些免疫效應并不能完全抑制旋毛蟲的生長發育，機體處于一種慢性持續感染的狀態，表明旋毛蟲能夠抑制和逃避宿主免疫反應[5]。旋毛蟲可能借助自身的蛋白發揮侵襲和寄生作用，其免疫機制在旋毛蟲發育、侵襲和寄生過程中起著重要作用[6]。近年來，旋毛蟲誘導宿主產生的免疫抑制作用備受關注，這種由旋毛蟲感染誘導宿主產生的免疫抑制作用對過敏性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤的發生和發展有著極大的推動作用，并為以上幾類疾病的研究和防控提供了新的思路和轉機[7-10]。

旋毛蟲不同發育時期產生的期特異性抗原可誘導宿主機體產生免疫應答[11-12]。多項研究表明旋毛蟲感染早期可誘導宿主產生免疫抑制作用，在這一階段蟲體發育迅速，蟲體形態和分泌產物不斷變化，經歷了感染性幼蟲的快速脫囊，侵入腸粘膜上皮細胞，4次蛻皮發育為成蟲，雌雄成蟲交配，雌蟲于感染后第4 d開始產新生幼蟲，最后新生幼蟲隨血液或淋巴液迅速移行并侵入骨骼肌的復雜發育變遷過程。據此推測旋毛蟲發育早期約6 d時間內的不同時間點對宿主的免疫調節存在復雜性和波動性。旋毛蟲感染抑制Th1 / Th17應答的同時誘導Treg細胞減少炎癥反應[13]，Th1 / Th2細胞對機體免疫功能的平衡有著至關重要的作用，平衡遭到破壞致使機體處于感染狀態[14]。根據這一特性，本研究檢測了旋毛蟲感染早期的4個關鍵時間節點小鼠腸系膜淋巴結相關細胞因子的表達情況，并進行了病理切片染色觀測，探究旋毛蟲感染早期對宿主免疫調節的機制。

1 材料與方法

1.1試驗動物及旋毛蟲蟲種 BALB/c鼠：6～8周，18～25 g，雌性，購自吉林大學醫學部動物中心。

旋毛蟲蟲種：中國河南豬旋毛蟲分離株(T1)，標準國際蟲種編號ISS534，由吉林大學人獸共患病研究所提供。

1.2主要試劑及儀器 無水乙醇、二甲苯、石蠟、液氮、眼科剪、眼科鑷、45 mm灌胃針、載玻片、蘇木素伊紅(HE)染液購自無錫市江原實業技貿總公司、MSD試劑盒(貨號：K150691-1)購自上海優寧維生物科技股份有限公司、讀板液購自上海優寧維生物科技股份有限公司、倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)、KD202A輪轉切片機(浙江金華科迪儀器設備有限公司)、MSD(型號：Quick Plex SQ120)。

1.3旋毛蟲攻蟲感染 本試驗共需48只BALB/c鼠，對其中24只健康鼠按照250條/只灌胃處理，并將剩余24只鼠設置為空白組進行對照。分別在感染后6 h、30 h、3 d、6 d，將試驗所需數量的感染鼠和空白鼠處理，無菌條件收集試驗材料。

1.4腸道蘇木素伊紅(HE)染色 于上述4個時間，每組處死3只感染組鼠及3只空白組鼠，無菌條件收集腸道組織。將組織進行常規包埋、切片，烘干后脫蠟。隨后加入試劑盒中的蘇木素染色液, 室溫孵育8 min。蒸餾水洗去多余染液, 使用分化液觀察分色情況。蒸餾水漂洗2 min，加入試劑盒中的伊紅染液, 室溫孵育1 min，蒸餾水沖洗20 s。無水乙醇脫水2 min后，浸入二甲苯透明處理10 min，樹膠封片，晾干后拍照。

1.5電化學發光免疫分析技術(MSD)檢測 于上述4個時間點，每組處死3只感染組鼠和3只空白組鼠，無菌條件收集腸系膜淋巴結，使用液氮速凍后儲存于-80 ℃冰箱中，用于IL-2、IL-4、IL-10、IL-17A、IFN-γ、TGF-β等細胞因子的檢測。將300 μL Linker與200 μL對應的生物素標記的抗體混合均勻，室溫孵育30 min。隨后加入200 μL的終止液混合均勻，室溫孵育30 min。包被MSD板，每孔加入50 μL抗體，室溫孵育1 h。使用1×PBS (0.05% Tween-20)清洗液將MSD板進行3次循環洗滌后加入25 μL的稀釋液，再加入25 μL的樣本,封口膜封上后室溫振蕩1 h。再次清洗MSD板3次后，每孔加入50 μL檢測抗體室溫振蕩1 h。再次清洗MSD板3次，加入150 μL讀板液，上機檢測，讀取結果。

1.6數據處理及統計分析 使用SPSS22.0軟件對以上細胞因子試驗數據采用t檢驗方法進行分析，檢驗水準為α=0.05。根據產生情況及其變化規律，并用GraphPad 5.0軟件繪圖并分析結果。

2 結 果

2.1腸道蘇木素伊紅(HE)染色結果 感染后不同時間點小腸病理切片觀察，與空白對照組相較，感染后6 h小腸組織炎性細胞浸潤；感染后30 h粘膜水腫，炎性細胞顯著增多；感染后3 d粘膜炎性細胞浸潤，粘膜損傷嚴重；感染后6 d粘膜及粘膜下層炎性細胞浸潤明顯，粘膜損傷加重，并伴有水腫。

圖1 不同時間點(A-E:空白對照、感染后6 h、30 h、3 d、6 d)腸道組織切片Fig.1 Intestinal tissue sections at different time points (A-E: blank control group,6 h, 30 h, 3 d,6 d after infection)

2.2電化學發光免疫分析(MSD)檢測結果 與空白對照組相比，感染組腸系膜淋巴結IL-2水平于感染后6 h顯著降低，3 d、6 d顯著升高，30 h無顯著變化；IL-4水平于感染后3 d、6 d顯著升高；IL-10水平于感染后6 h、30 h降低，但不顯著，3 d、6 d顯著升高；IL-17A水平于感染后6 d明顯降低，30 h、3 d顯著升高；IFN-γ水平于感染后3 d、6 d顯著升高；TGF-β水平于感染后30 h顯著升高，3 d、6 d升高，但不顯著。

3 討 論

旋毛蟲感染的同時對宿主產生強烈免疫調節作用[15-16]，大量研究表明在旋毛蟲的急性感染期和慢性感染期均可以促進Treg細胞的數量增加，旋毛蟲通過一個促使Treg細胞數量增加的網絡系統下調宿主的免疫應答情況[17]。此外，旋毛蟲對天然免疫系統也存在免疫抑制作用[18]。多數研究檢測為1 d以上感染天數的免疫調節情況，本試驗對此檢測時間提出不同看法，以BALB/c鼠為實驗動物，檢測旋毛蟲感染后肌幼蟲L1腸粘膜上皮細胞入侵期(6 h)，旋毛蟲成蟲初形成期(30 h)，以及3 d和6 d 4個時期宿主的腸系膜淋巴結免疫應答情況。此外，對4個時間點的感染組及空白組進行了組織切片染色觀察。

腸道病理染色結果顯示：旋毛蟲感染后6 h至6 d腸道的炎癥反應隨時間延長加重。MSD結果顯示免疫抑制存在于6 h時，表現為IL-2作為誘導Th1應答的重要細胞因子水平顯著降低,其他細胞因子無顯著變化，指示Th1免疫應答受到抑制；感染后30 h，TGF-β和IL-17A水平顯著升高，IL-17A作為炎性細胞因子可以強烈招募中性粒細胞，因而提示此時機體處于前炎癥反應階段；感染后3 d和6 d兩個時期，Th1型細胞因子(IL-2，IFN-γ)和Th2型細胞因子(IL-4，IL-10)水平均顯著升高，提示機體此時處于炎癥反應階段，呈現Th1 / Th2混合型免疫應答，這與Ilic等人[17]的發現近似。本研究發現旋毛蟲感染后6 h是旋毛蟲(肌幼蟲L1)侵入腸系膜上皮細胞的階段，此時腸道內的Th1型免疫抑制狀態有利于旋毛蟲(肌幼蟲L1)脫囊后至進入腸上皮細胞前免受Th1型免疫的殺傷和清除作用。旋毛蟲感染后30 h時已經完成4次蛻皮并發育為成蟲，但感染后30 h及更長時間的炎癥反應將無法徹底清除全部成蟲[19]，旋毛蟲發育肌幼蟲期宿主長期處于Th2型免疫反應，這種免疫反應是蟲體不同發育時期長期刺激宿主免疫系統的結果，旋毛蟲感染刺激宿主機體導致免疫失衡逐漸趨向Th2型免疫應答[20-21]，這種應答為以Th1型免應答失衡而導致的疾病帶來了新的治療方法，其主要原因是旋毛蟲感染能夠調節免疫失衡宿主(如：炎癥性腸病患者)的免疫平衡。

旋毛蟲感染后6 h腸道Th1型免疫應答受到抑制，并在感染后3 d和6 d 2個時期呈現Th1 / Th2混合型免疫應答，以及從感染后6 h至6 d腸道的炎癥逐漸加重的變化趨勢，反映了旋毛蟲感染早期對宿主免疫調節的復雜性，旋毛蟲通過誘導機體產生的Th2型免疫應答[22]，從而實現其在宿主體內長期寄生。本研究有助于闡明旋毛蟲感染早期誘導宿主產生的免疫抑制機制，為相關疾病的研究奠定基礎。

利益沖突：無