耐甲氧西林金黃色葡萄球菌殺白細胞素基因檢測

賴奮強，郭慶昕，楊 濱，鄭韻芳

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)是全世界范圍內的主要公共衛生問題，在美國每年因MRSA感染所致的死亡人數高于艾滋病[1]。這是由于社區獲得性MRSA(Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus，CA-MRSA)的發展所致，也是急診科中皮膚和軟組織感染的主要原因[2]。然而，分子特征決定CA-MRSA菌株在醫院外傳播和感染健康人群的能力仍然很差[3]。細胞溶解肽，α-型苯酚可溶蛋白(Phenol-soluble modulinsα，PSMα)和α-毒素(α-toxin，hla)對CA-MRSA疾病的進展起決定性作用[4-5]，這兩種毒力因子并非專門出現在CA-MRSA中，基因表達的差異可部分解釋CA-MRSA菌株增強毒力的原因[4]。值得注意的是許多CA-MRSA菌株攜帶有編碼殺白細胞素(Panton-Valentine leukocidin，PVL)的lukSF-PVL基因，而其他菌株中lukSF-PVL較少[3]，因此，PVL已被認為是導致CA-MRSA毒力增加的主要因素之一[6]。

1 材料與方法

1.1菌株來源 83株分離菌來自于某綜合三甲醫院臨床各科室送檢的痰、血液、傷口分泌物、耳道分泌物、尿液、膿液、無菌體液等標本，經臨床微生物室分離鑒定的非重復MRSA菌株；按美國疾病預防控制中心(CDC)的CA-MRSA 定義為：患者在門診或入院48 h之內分離到MRSA菌株；1年內無住院或與醫療機構接觸史； 沒有留置各種導管及其他穿透皮膚的醫用裝置[3]，將臨床分離的MRSA菌株分成醫院獲得性MRSA(HA-MRSA)組與CA-MRSA組。金黃色葡萄球菌質控菌株ATCC29213為福建醫科大學附屬第一醫院微生物室保存；SCCmec分型標準菌株為同濟大學附屬上海肺科醫院余方友教授饋贈。

1.2 儀器與試劑

1.2.1主要儀器 Vitek-2全自動細菌檢測系統購于法國生物梅里埃有限公司，恒溫培養箱購于上海躍進醫療器械有限公司，PCR儀購于Eppendorf有限公司，電泳儀購于北京六一儀器廠，凝膠成像儀購于上海山富科學儀器有限公司，臺式高速離心機購于北京時代北利離心機有限公司。

1.2.2主要試劑 血瓊脂平板、革蘭陽性菌鑒定卡GP、革蘭陽性菌藥敏卡GP67均購于法國生物梅里埃有限公司，溶菌酶緩沖液、溶菌酶、細菌基因組提取試劑盒均購于上海生工生物工程公司，PCR反應 10×Buffer、dNTP、6×Loading Buffer、100 bp DNA Ladder Marker、rTaq DNA聚合酶購于大連寶生TaKaRa有限公司，PCR引物由上海生工生物工程公司合成

1.3 研究方法

1.3.1基因組提取 取培養過夜的金黃色葡萄球菌單個菌落1個，接種于滅菌腦心浸液肉湯中，36 ℃培養過夜。取 1 mL 過夜培養的細菌菌液，加入 1.5 mL 離心管中，室溫 8 000 r/min 離心 1 min，棄上清，收集菌體，加入 180 μL的溶菌酶溶液重懸菌液，37 ℃水浴 60 min，其余步驟按細菌基因組提取試劑盒說明書進行。得到的DNA用50～100 μL TE緩沖液溶解并立即-20 ℃保存。

1.3.2SCCmec分型 擴增引物和實驗方法參照文獻[7]，結果判讀以Marker為基準，結合SCCmec標準菌株在相應位置出現熒光條帶為陽性。

1.3.3spa分型 擴增引物和實驗方法參照文獻[8]，將PCR產物送上海生工生物工程有限公司單向測序，觀察測序結果峰圖，確認序列的質量。spa基因24 bp重復序列區域的兩端是相對保守的，其5′端的標志序列RCA MCA AAA(與重復序列的5′端起始相距0 bp),3′端的標志序列為TAY ATG TCG T(與重復序列的3′端末尾相距19 bp或18 bp)。按照上述規則截取重復序列區域，并按照24 bp分割成不同的重復單元(repeats)，登陸官方網站http://spa.ridom.de/spatypes，查詢各菌株的spa分型。

1.3.4PVL基因檢測 擴增引物和實驗方法參照相關文獻[9]，選取部分擴增產物送上海生工生物工程有限公司進行測序確認。

1.4統計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，計數資料數據采用百分比(%)表示，χ2檢驗；分類計數資料總例數n≤40或T<1時，采用Fisher確切概率法(Fisher exact probability test)；以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1送檢科室分布 83株MRSA中18(21.7%)株來自于耳鼻喉科，16(19.3%)株來自于皮膚科，9(10.8%)株來自于血管外科，6(7.2%)株來自于骨科，5(6.0%)株來自于呼吸內科，5(6.0%)株來自于兒科，4(4.8%)株來自于重癥醫學科。39株HA-MRSA中5(12.8%)株來自于骨科，4(10.3%)株來自于耳鼻喉科，4(10.3%)株來自于呼吸內科，4(10.3%)株來自于重癥醫學科；44株CA-MRSA中15(34.1%)株來自于皮膚科，14(31.8%)株來自于耳鼻喉科，6(13.6%)株來自于血管外科，4(9.1%)株來自于兒科，詳見表1。

表1 83株MRSA送檢科室分布
Tab.1 Departments distribution of the 83 MRSA delivered

送檢科室MRSA/%n=83HA-MRSA/%n=39CA-MRSA/%n=44耳鼻喉科18(21.7)4(10.3)14(31.8)皮膚科16(19.3)1(2.6)15(34.1)血管外科9(10.8)3(7.7)6(13.6)骨科6(7.2)5(12.8)1(2.3)呼吸內科5(6.0)4(10.3)1(2.3)兒科5(6.0)1(2.6)4(9.1)重癥醫學科4(4.8)4(10.3)0(0.0)其他科室20(24.1)17(43.6)3(6.8)

注：其他科室包括肝膽胰外科、神經外科各3株，干部病房、神經內科、胃腸外科、胸外科、眼科各2株，甲狀腺科、康復科、泌尿科、內分泌科各1株。

2.2基因分型結果 83株MRSA中HA-MRSA39株，CA-MRSA44株；SCCmec分型檢出4個分型，SCCmecⅠ1株(1.2%)SCCmecⅡ3株(3.6%)SCCmecⅢ54株(65.1%)SCCmecⅣa24株(28.9%)；39株HA-MRSA中SCCmecⅠ1株(2.6%)SCCmecⅡ3株(2.7%)SCCmecⅢ32株(82.1%)SCCmecⅣa2株(5.1%)未知分型1株(2.6%)；44株CA-MRSA中SCCmecⅢ22株(50.0%)SCCmecⅣa22株(50.0%)。spa分型中83株MRSA共檢出15個型，主要分型為t437共33(39.8%)株，t062共18(21.7%)株,t015共9(10.8%)株；HA-MRSA 的主要spa分型t437為11(28.2%)株，t062為 9(23.1%)株，t015為4(10.3%)株，t030為4(10.3%)株；CA-MRSA 中t437為22(50.0%)株，t062為9(20.5%)株，t015為 5(11.4%)株。

2.3PVL基因檢測結果 PVL總陽性率24.3%(20/83)，HA-MRSA陽性率10.3%(4/39)，4株PVL陽性的菌株全部為SCCmecⅢ，CA-MRSA陽性36.4%(16/44)，12株PVL陽性為SCCmecⅣa，4株PVL陽性為SCCmecⅢ，在PVL陽性率上HA-MRSA與CA-MRSA比較(圖2)，P=0.006，差異有統計學意義。部分菌株PVL凝膠電泳圖見圖1。

1: 100 bp DNAmarker; 2-4: PVL positive samples; 5-6: PVL negative samples圖1 部分菌株PVL凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of PVL

33株spat437中有18株攜帶PVL基因，陽性率54.5%，50株其他spa分型中僅2株攜帶PVL基因，陽性率4.0%，兩組比較(圖3)P=0.000，差異有統計學意義。

圖2 HA-MRSA與CA-MRSA PVL攜帶率比較Fig.2 Comparison of PVL between HA-MRSA and CA-MRSA

2.4PVL基因陽性的MRSA特征 9株為CA-MRSA-Ⅳa-t437， 4株為HA-MRSA-Ⅲ-t437，3株為HA-MRSA-Ⅳa-t437， 2株為CA-MRSA-Ⅲ-t437，CA-MRSA-Ⅲ-t015 和CA-MRSA-Ⅲ-t062各 1株；20株PVL基因陽性的MRSA中10株分離自皮膚軟組織感染病例，6株分離于耳鼻喉科感染病例，3株分離于呼吸道感染病例，1株分離于敗血癥病例，詳見表2。

表2 PVL基因陽性的MRSA特征
Tab.2 Characteristics of PVL gene positive MRSA

科室臨床診斷標本類型MRSA類型SCCmec分型spa分型小兒外科頜下腺膿腫膿液CAⅣat437整形外科皮膚慢性潰瘍分泌物HAⅣat437眼科淚囊炎分泌物CAⅣat437耳鼻喉科中耳炎分泌物CAⅣat437血管外科肺栓塞痰HAⅢt437重癥醫學科小腦出血痰HAⅢt437耳鼻喉科慢性鼻竇炎分泌物CAⅣat437血管外科左下肢腫脹分泌物HAⅣat437皮膚科蕈樣肉芽腫分泌物HAⅣat437甲狀腺科甲狀腺腫物分泌物HAⅢt437皮膚科多形紅斑分泌物CAⅣat437重癥醫學科頭頸外傷痰HAⅢt437兒科敗血癥血液CAⅣat437耳鼻喉科外耳炎分泌物CAⅣat437小兒外科乳腺膿腫膿液CAⅢt437神經外科神經纖維瘤分泌物CAⅣat437耳鼻喉科外耳炎分泌物CAⅢt437耳鼻喉科化膿性中耳炎分泌物CAⅣat437皮膚科特應性皮炎分泌物CAⅢt015小兒外科頸部膿腫膿液CAⅢt062

圖3 spat437與其他spa分型PVL攜帶率比較Fig.3 Comparison of PVL between t437 and other spa type

3 討 論

金黃色葡萄球菌的毒力包括為各種酶、毒素、侵襲力、表面蛋白等，根據基因編碼位置的不同可以分為兩大類，一類是編碼在可移動元件(MGE)上的毒力包括各種類型的超抗原如中毒性休克綜合征毒素、腸毒素，殺白細胞素(PVL)和剝脫性毒素，另一類是金黃色葡萄球菌的固有毒力，如α-毒素，β-毒素，酚可溶性調節肽(PSM)，幾乎所有菌株均攜帶，但是不同毒素基因的表達水平不同可表現出不同致病性。

CA-MRSA較 HA-MRSA具有更強的毒力已成為近年來MRSA毒力水平研究的熱點， CA-MRSA菌株顯示出相當大的逃避中性粒細胞吞噬的能力，并且已逐漸成為常識。微生物學專家就CA-MRSA毒力增加的原因提出兩種假說來解釋，一個是CA-MRSA從MGE中獲得PVL[10]；另一個是CA-MRSA促進核心基因組編碼的毒力基因的表達，如PSMα、hla等[11]；但這兩個假說相互之間并無沖突，可以一起來增加CA-MRSA的毒力。

本研究中83株MRSA的PVL陽性率為24.1%，CA-MRSA(36.4%)>HA-MRSA(10.3%)，結果顯示CA-MRSA菌株更容易攜帶PVL基因。PVL是葡萄球菌殺白細胞的雙組分家族的成員，由原噬菌體編碼的兩個相鄰lukS和lukF基因編碼，其產生兩種毒素部分(LukS和LukF)，兩者都是細胞溶解活性所必需的成分。在CA-MRSA流行的初期，PVL基因lukS和lukF幾乎被發現于所有CA-MRSA克隆中，而PVL通常不存在于HA-MRSA中[10]。在動物感染模型中與同基因的PVL陰性變異體相比，含有PVL的CA-MRSA顯示明顯增加的發病率和死亡率，表明PVL在嚴重CA-MRSA相關性疾病的發展中的重要作用，PVL對發病機制的貢獻可認為其能溶解中性粒細胞的作用相關聯[12]，同時PVL陽性菌株高表達spa，增加了PVL對中性粒細胞和巨噬細胞的裂解能力，增加炎癥介質的釋放，導致組織炎癥和壞死[13]。而核心基因組編碼的毒力PSMα在CA-MRSA菌株的皮膚感染模型中的毒力起相當大的作用，雖然PSM基因存在于所有金黃色葡萄球菌中，但CA-MRSA菌株較HA-MRSA菌株產生更多的PSM[11]。此外，α-毒素則可以顯著影響皮膚和肺部感染模型中的CA-MRSA毒力，雖然對人中性粒細胞不溶細胞，但α-毒素裂解一系列其他細胞，例如紅細胞和巨噬細胞，并且有助于破壞上皮屏障[14]。agr調控系統作為金黃色葡萄球菌毒力基因全局調控的重要開關，調控包括PSMα、α-毒素、δ-毒素和其他的毒力決定簇的高表達，在CA-MRSA高毒力中發揮重要的作用，同時PVL基因的高表達干擾了agr調控系統，也可能增強CA-MRSA毒性[15]。

從分子流行學特征出發，本研究中20株PVL陽性的MRSA中，18株為spat437型，占90.0%，其中CA-MRSA-Ⅳa-t437共9株，占45.0%，同時spat437型也是本研究的主要基因型，CA-MRSA(50.0%)和HA-MRSA(28.2%)，該型是我國健康人群中攜帶率最高的MRSA基因型[16]，在spaRIDOM 官方網(http://www.spaserver.ridom.de)上排名第17位，頻率為0.73%，共有2 890株(2018年2月)。研究發現spat437型的克隆絕大部分屬于ST59型[17-18]，該克隆是我國南方、鄰近亞洲國家及部分歐洲國家最常見的CA-MRSA菌株[19-20]。值得注意的是本研究中有7株HA-MRSA的PVL基因陽性，SCCmec分型中4株為Ⅲ，3株為Ⅳa，提示攜帶有更高毒力的CA-MRSA克隆已經播散到醫院環境中引起醫院獲得性相關感染如肺炎和手術切口感染。近年來國內外相關研究發現有10%～80%的院內感染菌株具有CA-MRSA的分子特征[21]，雖然CA-MRSA進入院內并取代經典的HA-MRSA菌株的爭議目前尚無定論，但是有學者認為CA-MRSA通常攜帶較小的SCCmecⅣ型和SCCmecⅤ型的元件，更便捷的轉移性，更強的適應性，更容易在不同遺傳背景中的菌株中轉移[22]，因此推斷在醫院獲得性相關感染中CA-MRSA克隆與HA-MRSA克隆將會共存。

利益沖突：無