龍巖市239株沙門菌毒力基因檢測結果分析

曹春遠，陳前進，陳小東，鐘葉平，李美華，陳海濱

沙門菌是最重要的人獸共患傳染性疾病的病原菌之一，大多數有很強的致病力，對人類健康和禽畜養殖業造成重大危害，并且是最重要的人類食源性致病菌之一，是目前的重大公共衛生問題之一。研究表明沙門菌致病主要是因為大量毒力因子相互作用導致[1]，毒力相關的基因因此成為近年研究的重點。毒力基因作為沙門菌致病特性的遺傳物質，也長期在發生著變遷進化。為了解龍巖市沙門菌毒力基因攜帶與變遷情況，本文收集了1991-2017年間239株沙門菌進行9種毒力基因檢測分析，為龍巖市沙門菌病的防制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1菌株來源 收集1991-2017年239株沙門菌。其中，179株分離自人體樣本(主要從本市綜合醫院臨床病人糞便樣本分離，少部分分離自飲食從業人員肛拭樣本)，60株分離自禽畜肉等食品監測樣本。

1.1.2主要儀器與試劑 VITEK 2 Compact(法國梅里埃)，PCR擴增儀(德國Biometra)，三恒多用電泳儀(北京六一儀器廠)，凝膠成像儀(法國)。泰國S&A公司沙門菌分型血清，premix、100 bp MARKER為TAKARA產品。

1.2 方 法

1.2.1菌株復核鑒定 用VITEK 2 Compact GN鑒定卡進行復核鑒定。血清分型參照Kauffman- White標準,其中鞭毛誘導實驗參照GB 4789.5-2016方法。

1.2.2毒力基因檢測 用PCR方法檢測沙門菌9個毒力基因的片段，包括：sopB、invA、sifA、sscA、sseE、spvB、pefA、spvR、spvC等，引物序列與擴增程序和體系配制參考文獻[2-3]，見表1。引物序列由上海生工合成。核酸提取應用水煮沸法。

表1 9個毒力基因片段檢測用引物序列
Tab.1 Primer sequences for detection of 9 virulence gene fragments

引物名稱位置引物序列5′-3′擴增片段長度來自文獻invASPI-1F:TATCGCCACGTTCGGGCAATCTTR:TCGCACCGTCAAAGGAACCACT275[2]sopBSPI-1F:GGACCGCCCAGCAACAAAACAAGAAGAAGR:AGTGATGCCCGTTATGCGTCAGTGTATT220[2]sifASPI-2F:TTTGCCGAACGCGCCCCCACACGR:GTTGCCTTTTCTTGCGCTTTCCACCCATCT449[2]sscASPI-2F:ATGAAAAAAGACCCGACCTAR:TTAGCTCCTGTCAGAAAGTT474[3]sseESPI-2F:ATGGTGCAAGAAATAGAGCAR:TTAAAAACGTCGCTGGATAA417[3]spvB毒力質粒F:GGTTACTGCATGACAGTAACGGCR:CGCAAAGCTTGTTCAGTATCGG561[2]pefA毒力質粒F:GCGCCGCTCAGCCGAACCAGR:CAGCAGAAGCCCAGGAAACAGTG157[2]spvR毒力質粒F:AGGAAATCGGACCTACGGR:TAACATCGCCAGCCCTTG473[3]spvC毒力質粒F:AAGGTCGTTCAACAAGCCR:CATTTCACCACCATCACG252[3]

1.3數據處理 應用EXCEL2007軟件進行數據整理，利用SPSS18.0軟件包進行統計分析，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1菌株復核鑒定結果 所有239株待檢菌株經VITEK 2 Compact GN鑒定卡復核鑒定，均提示為沙門菌。經血清復核鑒定，結果為：腸炎沙門菌91株、鼠傷寒沙門菌58株，這2種血清型沙門菌占了62.3%(149/239)，其余詳見表2。

2.2各種毒力基因片段檢出情況 239株沙門菌均檢出invA和sopB，檢出率為100%(239/239)；237株檢出sseE，檢出率為99.2%(237/239)；227株檢出sscA，檢出率為95.0%(227/239)；204株檢出sifA，檢出率為85.4%(204/239)；170株檢出spvC，檢出率為71.1%(170/239)；pefA、spvB、spvR等3種基因均有111株菌檢出，檢出率為46.4%(111/239)。

2.3毒力基因片段陽性檢出數及結果模式 239株沙門菌中，共檢出毒力基因1 649個，平均每菌株檢出毒力基因6.9種。其中，95株檢出全部9種毒力基因，占39.8%(95/239)；67株檢出5種毒力基因，占28.0%(67/239)；44株檢出6種毒力基因，占18.4%(44/239)；此3類合計為86.2%。根據不同毒力基因片段的陽性檢出結果不同，可得到不同的陽性檢出結果模式，而不同血清型沙門菌主要檢出的毒力基因片段的模式也不同。檢測菌株數較多的腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、斯坦利沙門菌、都柏林沙門菌的毒力基因陽性檢出結果共有13種模式(詳見表3)。其中，腸炎沙門菌以模式1(即檢出全部9種毒力基因)為主，有76株，占83.5%(76/91)；鼠傷寒沙門菌以模式12、模式10(invA、sopB、sseE、sscA、sifA等5種毒力基因陽性，spvB、spvR、pefA等3種毒力基因陰性，spvC陰性或陽性)為主，共45株，占77.6%(45/58)；斯坦利沙門菌也是以模式10、模式12為主，共8株，占66.7%(8/12)；都柏林沙門菌以模式1為主，有3株，占37.5%(3/8)。可見，在這4種常見血清型沙門菌中，模式1、模式10、模式12是比較主要的毒力基因陽性結果模式。

表2 龍巖市不同血清型沙門菌毒力基因檢出情況
Tab.2 Virulence gene detection of different serotypes ofSalmonellain Longyan City

沙門菌血清型名稱菌株數invAsopBsseEsscAsifAspvCspvBspvRpefA毒力基因數陽性菌株數(%)陽性菌株數(%)陽性菌株數(%)陽性菌株數(%)陽性菌株數(%)陽性菌株數(%)陽性菌株數(%)陽性菌株數(%)陽性菌株數(%)總數每菌株平均數腸炎91911009110091100911008087.9 8694.5 8795.6 8795.6 8087.9 7848.6 鼠傷寒58581005810058100581005798.3 3255.2 1017.2 1119.0 1220.7 3546.1 斯坦利12121001210012100121001083.3 975.0 18.3 18.3 216.7 715.9 都柏林88100810081008100787.5 675.0 675.0 562.5 450.0 607.5 紐波特5510051005100510051005100000000306.0 乙型副傷寒551005100510051005100360.0 000000285.6 德爾卑44100410041004100375.0 125.0 000000205.0 里森331003100310031003100133.3 000000165.3 傷寒221002100210021002100210021002100150.0 178.5 豬霍亂2210021002100210021002100000000126.0 阿貢納111001100110011001100110000000066.0 海德爾堡111001100110011001100110000000066.0 雞111001100110011001100110011001100110099.0 科特布斯1110011001100110011000000000055.0 魯齊齊1110011001100110011000000000055.0 倫敦111001100110011001100110000000066.0 明斯特1110011001100110011000000000055.0 山夫登堡1110011001100110000.0 0000000044.0 圣保羅1110011001100110011000000000055.0 印第安納1110011001100110011000000000055.0 未分型3939100391003794.92769.22153.8 1948.7410.3410.31128.22015.2合計23923910023910023799.222795.020485.417071.111146.411146.411146.416496.9

表3 腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、斯坦利沙門菌、都柏林沙門菌各毒力基因陽性檢出結果模式
Tab.3 Virulence gene positive detection patterns ofS.enteritidis,S.typhimurium,S.stanleyandS.dublin

模式invAsopBsseEsscAsifAspvCspvBspvRpefA腸炎沙門菌鼠傷寒沙門菌斯坦利沙門菌都柏林沙門菌1+++++++++7610132+++++-+++10003++++-++++20004++++++-++01005+++++++-+00016++++++++-00027++++--+++10008++++-+++-70009++++++--+011010++++++---0205011++++-+---102012+++++----3253113++++-----0101

注：“+”表示陽性檢出，“-”表示未檢出。

2.5不同年代沙門菌毒力基因陽性檢出菌株數比較 由于invA、sopB等2種毒力基因的檢出率均為100%，所以在所有年代都無差異；sseE、spvC在不同年代間也沒有差異，顯示了較好的穩定性；而sifA、spvC、spvB、spvR、pefA等5種毒力基因在不同年代沙門菌中最少檢出數差異具有統計學意義，表明龍巖沙門菌攜帶這5種毒力基因的菌株數量隨著時間的進程而增加，詳見表4。

表4 龍巖市不同年代沙門菌9種毒力基因陽性檢出菌株數比較
Tab.4 Comparison of nine virulence gene positive strains ofSalmonellain Longyan in different years

年代檢測菌株數invAsopBsseEsscAsifAspvCspvBspvRpefA1991-20001111111111100082001-2010424242414136271212132011-2017186186186185185167133999990趨勢卡方值(χ2)///1.5095.9431.993.0718.2618.267.39P值///=0.5<0.001<0.0010.2<0.001<0.001=0.025

2.6人體樣本和食品樣本分離株毒力基因陽性檢出數比較 人體樣本分離的沙門菌以檢出9種、5種、6種毒力基因的菌株為主，共157份，占87.8%，食品樣本分離的沙門菌以檢出9種、5種毒力基因的菌株為主，共45株，占75%，均明顯高于攜帶其它毒力基因種數的菌株。但兩類不同來源沙門菌毒力基因陽性檢出菌株數差異無統計學意義(χ2=0.7，P=0.998)。見表5。

表5 不同來源沙門菌不同種類數毒力基因陽性檢出菌株數比較
Tab.5 Comparison of virulence gene positive strains ofSalmonellafrom different sources

毒力基因種類數陽性菌株數人源(n=179)食源(n=60)96728550176404775473862211310卡方檢驗χ2=0.7,P=0.998

3 討 論

沙門菌是與人類關系最密切的致病菌，可引起食物中毒，以及胃腸炎、菌血癥或敗血癥、腸熱癥等多種疾病。本研究結果表明，龍巖市沙門菌感染以腸炎沙門菌與鼠傷寒沙門菌為主，共占62.3%(149/239)。毒力是沙門菌致病的根本原因，是由分布于其中的許多毒力基因相互作用而產生的。沙門菌毒力基因主要由染色體上的毒力島(Salmonella pathogenicity island，SPI)編碼，少數由毒力質粒(plasmid)編碼[4]。

目前已發現的SPI有SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4、SPI-5等20多個[5]。其中SPI1遺傳性穩定，是沙門菌入侵宿主非吞噬細胞所必需的，在侵襲巨噬細胞和腸上皮細胞過程中發揮重要作用，幾乎所有沙門菌血清型都具有[6]。SPI2主要控制沙門菌在吞噬細胞和上皮細胞內進行復制，使其逃避巨噬細胞輔酶依賴的殺傷作用。SPI2編碼與系統感染有關的Ⅲ型分泌系統，主要有sse、ssc、ssa和ssr等基因。其中，sse編碼分泌系統效應蛋白，ssc編碼分子伴侶，ssa編碼Ⅲ型分泌系統成分，ssr編碼分泌系統調節子[3]。所以，本研究重點選擇SPI1中的invA與sopB毒力基因，SPI2中的sifA、sseE、sscA毒力基因進行研究。

invA是沙門菌屬特異性基因[7]，是主要毒力因子，決定沙門菌的侵襲力，與其致病性密切相關[8]。sopB基因編碼參與腸黏膜液體分泌和炎癥反應的相關蛋白。invA與sopB這2種基因都是SPI標志性基因[9]，在本研究中，其檢出率均為100%，與楊勁松(福建省臨床腸炎沙門菌)[2]、夏賓雁(四川山羊源沙門菌)[10]、孫璐(山東肉雞屠宰生產鏈中沙門菌)[11]研究結果一致，與彭斌[12]從新疆零售牛肉中沙門菌的研究結果相比，invA的檢測結果一致，而sopB檢出卻相差很大(7.1%)，這是否與沙門菌分離的地域或物種有關尚待研究。SPI2中的3種毒力基因檢出率都在85%以上。曹恬雪等研究表明攜帶SPI1+SPI2與沙門菌的致病性呈正相關[13]，研究表明龍巖市沙門菌的毒力較強。

在沙門菌的毒力質粒中，spv(Salmonella plasmid virulence genes)是最重要的毒力質粒，包括spvA、spvB、spvC、spvD、spvR、pefA等基因，有助于提升沙門菌在宿主細胞內的粘附能力、存活時間及繁殖能力等，從而提升其在宿主細胞內的生存能力[14]。spv表現為細胞毒性，與腸系膜淋巴結、脾、肝等腸道外組織感染有關[3]。pefA基因是菌毛操縱子基因，在感染階段發揮重要作用，通過伴侶誘導的裝配途徑調節細菌對腸上皮細胞的粘附[15]。pefA、spvC基因是沙門菌毒力質粒上特有的標志性基因[1,9]。

毒力質粒的攜帶與特定的血清型有關，目前已報道的攜帶毒力質粒的沙門菌血清型有11種，包括鼠傷寒沙門菌、豬霍亂沙門菌、腸炎沙門菌、都柏林沙門菌、丙型副傷寒沙門菌、雞沙門菌、布利丹沙門菌、御成門沙門菌、阿貢納沙門菌、S.sendai、S.abortusovis[10]。本研究中，不僅從腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、都柏林沙門菌、豬霍亂沙門菌、阿貢納沙門菌、雞沙門菌中檢出spvC，還從倫敦沙門菌、斯坦利沙門菌、紐波特沙門菌、乙型副傷寒沙門菌、德爾卑沙門菌、里森沙門菌、傷寒沙門菌、海德爾堡沙門菌等8種血清型沙門菌中檢出spvC，但僅從腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、都柏林沙門菌、雞沙門菌、斯坦利沙門菌、傷寒沙門菌中檢出pefA。這可能與樣品來源及地域差異有關，值得進一步研究。

本研究中，腸炎沙門菌4種質粒毒力基因的檢出率均在87%以上，與鼠傷寒沙門菌的陽性檢出率差異有統計學意義。其它血清型沙門菌由于菌株數較少，有待收集到更多菌株后再作進一步比較分析。

本研究中沙門菌spvC檢出率為71.1%，其中腸炎沙門菌spvC陽性檢出率更是高達94.5%：分離自人體樣本的63株腸炎沙門菌58株檢出spvC，陽性率為92.1%(58/63)，分離自食品樣本的28株腸炎沙門菌均檢出spvC，陽性率100%，沒有統計學差異(χ2=1.07，P=0.3)。龍巖市spvC的檢出率高于莊孝飛2008-2012年上海(食源性+醫源性)腸炎沙門菌分離株中spvC的檢出率(78.9%)[1]、遠高于夏賓雁山羊源沙門菌spvC的陽性檢出率(47.6%)[10]和張芬2006-2013年間于寧波地區沙門菌中spvC的檢出率(21.9%)[16]，更有甚者，彭斌在新疆零售牛肉中分離的沙門菌中未檢出spvC[12]。表明龍巖市沙門菌特別是腸炎沙門菌spvC毒力基因攜帶率高于全國各地的水平，同時由于龍巖市沙門菌spvC毒力基因在不同年代間相對穩定，那么這種差異可能與各種血清型沙門菌構成不同、地域不同、來源物種不同有關，有待進一步研究分析。

本研究結果還顯示，龍巖市沙門菌除invA、sopB、sseE、spvC等4種毒力基因陽性檢出數量隨著時間的進程相對穩定外，其余5種毒力基因特別是質粒毒力基因的陽性檢出數隨時間進程呈現顯著性增加，表明龍巖市沙門菌質粒毒力基因有累積增強趨勢，這一方面主要與質粒本身的特性有關：質粒存在于細菌細胞漿中，獨立于染色體而存在，是細菌重要的遺傳物質，可提高細菌選擇有利生存條件的能力，使細菌在特殊的環境下生存和生長，并且通過在種內、種間甚至屬間進行DNA交換轉移使其生存能力不斷因進化而增強，并同時實現毒力基因的累積增強；另一方面也可能這些毒力基因是以轉座子等其它因子形式存在于菌體內的，進而增強了菌株的毒力。

根據劉芳萍[17]、黃瑞[18]等的研究結果，攜帶毒力基因較多的菌株致病性也較強，特別是攜帶spvC基因的菌株大多數表現為強致病性。本次研究的9種毒力基因在龍巖市沙門菌的檢出率均高于45%，平均每菌株檢出毒力基因數為6.9種，檢出毒力基因達5種以上的菌株數共226株，占94.56%。所有菌株均檢出invA、sopB2種SPI1毒力基因，絕大部分菌株檢出SPI2毒力基因中的sseE、sscA、sifA，超過70%菌株檢出spvC，spvB、spvR、pefA陽性檢出率均為46.4%。其中腸炎沙門菌以檢出全部9種毒力基因為主，占83.5%(76/91)；鼠傷寒沙門菌以invA、sopB、sseE、sscA、sifA陽性，spvB、spvR、pefA陰性結果多見，占77.6%(45/58)。結果表明龍巖市沙門菌攜帶較多的毒力基因，臻病性較強。本研究結果還顯示食源性與人源性分離株攜帶毒力基因無顯著性差異，表明龍巖市食源性與人源性沙門菌交叉污染/感染特別嚴重，應同步加強人、禽、畜沙門菌病的監測與管理。

利益沖突：無